背景簡(jiǎn)介

CD4+T細(xì)胞指的是表面有CD4分子的T淋巴細(xì)胞，是外周淋巴組織中的初始T細(xì)胞在受到抗原攻擊后分化產(chǎn)生的一種效應(yīng)T細(xì)胞，主要通過產(chǎn)生細(xì)胞因子參與細(xì)胞免疫。

作為淋巴細(xì)胞的主要組分，CD4+T細(xì)胞具有多種生物學(xué)功能，如產(chǎn)生多種細(xì)胞因子直接殺傷靶細(xì)胞，調(diào)節(jié)B細(xì)胞活化并產(chǎn)生抗體，并與其它的免疫細(xì)胞細(xì)胞共同協(xié)作，保護(hù)機(jī)體免受病原體以及腫瘤的侵害。

細(xì)胞基本信息

細(xì)胞名稱：小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞

分離方法：磁珠分選

組織來源：C57小鼠脾臟

細(xì)胞形態(tài)：圓形、淋巴母細(xì)胞樣

生長特性：懸浮生長

細(xì)胞形態(tài)

小鼠CD4+T細(xì)胞是一種懸浮細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)呈圓形，細(xì)胞可傳5代左右；3代以內(nèi)狀態(tài)最佳。

小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞特點(diǎn)

1.免疫識(shí)別

在CD4共受體和T細(xì)胞受體(TCR)-CD3復(fù)合物的共同作用下，TCR識(shí)別抗原MHC II復(fù)合體，同時(shí)在細(xì)胞因子的作用下，CD4+T細(xì)胞增殖活化并發(fā)揮免疫學(xué)功能;

2.細(xì)胞殺傷

通過分泌IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的增殖和顆粒酶的釋放或直接殺傷腫瘤細(xì)胞，從而更有效的發(fā)揮腫瘤免疫功能;

3.可分化為多個(gè)亞群

CD4+T細(xì)胞具有極強(qiáng)的可塑性，其可極化為Th1、Th2、Th17和Treg細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞，從而在疾病中發(fā)揮不同作用;

4.免疫調(diào)節(jié)功能

除了促進(jìn)CD8+T細(xì)胞活化外，在CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的多種細(xì)胞因子中，IL-2、IL-4、IL-6等細(xì)胞因子也是調(diào)節(jié)B細(xì)胞、NK細(xì)胞等細(xì)胞活化的關(guān)鍵細(xì)胞因子

5.免疫記憶功能

CD4+記憶T細(xì)胞機(jī)體受到病原體的二次侵入時(shí)，可在抗原提呈細(xì)胞的作用下再次增殖分化，從而更快速的發(fā)揮免疫殺傷作用。

小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞分離培養(yǎng)步驟

材料準(zhǔn)備

工具：4-6周C57小鼠、小鼠CD4+T 細(xì)胞分選試劑盒 、紅細(xì)胞裂解液、眼科鑷、眼科剪、細(xì)胞篩網(wǎng)、PBS緩沖液、小鼠脾臟CD4+T 細(xì)胞專用培養(yǎng)基

提前開啟紫外線照射超凈臺(tái)30min：將培養(yǎng)基和添加劑室溫融化，使用前室溫中預(yù)溫10-30 min。HBSS緩沖液緩沖液預(yù)冷，紫外照射完畢后，75%酒精消毒超凈臺(tái)，超凈臺(tái)通風(fēng)10 min以上。

培養(yǎng)瓶：準(zhǔn)備25cm2的培養(yǎng)瓶。

操作步驟

1.處死小鼠，無菌取出脾臟，在70 μm 細(xì)胞篩網(wǎng)上研磨脾臟，以預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞篩網(wǎng)，收集細(xì)胞懸液于 50 mL 離心管中，500 g，離心5 min。

2.離心結(jié)束，棄上清，加入5 mL紅細(xì)胞裂解液(ACK)，室溫裂解5 min，再加入20 mL PBS，500 g， 離心5 min。

3.將脾細(xì)胞重懸于PBS，細(xì)胞懸液用70 μm 細(xì)胞篩網(wǎng)過濾后，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×108 cells/mL。

4.按照每100 μL 細(xì)胞懸液(1×107個(gè)細(xì)胞)對(duì)應(yīng)2 μL Biotin-Antibody Mix加入無菌流式管底部，混勻后 4°C 孵育10 min。

5.孵育完成后，在流式管中加入 20 μL Streptavidin磁珠 (1×107個(gè)細(xì)胞)(使用前渦旋振蕩重懸磁珠，確保磁珠完 全重懸)，混勻后4°C 孵育10 min。

6.孵育完成后，在流式管中加入2.5 mL分選buffer，用移液器上下混合吹打5次混勻(避免劇烈振蕩或者 上下顛倒混勻)。

7.將含有細(xì)胞的流式管置于磁力架上，靜置5 min。將細(xì)胞懸液輕柔倒入一個(gè)無菌離心管中(傾倒過程中流式管不要脫離磁力架)，此細(xì)胞懸液中即包含 純化的小鼠CD4+T細(xì)胞，500 g，離心5 min。離心后棄上清，收集細(xì)胞， 將細(xì)胞重懸于培養(yǎng)基中，即可用于后續(xù)擴(kuò)增。

細(xì)胞標(biāo)志物鑒定

CD4是CD4+T細(xì)胞重要的標(biāo)記物,也是識(shí)別CD4+T細(xì)胞最可靠的標(biāo)志。

小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)

輕輕吹打T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基使細(xì)胞懸浮。

吸取培養(yǎng)瓶中所有培養(yǎng)基，在離心機(jī)中以1000轉(zhuǎn)離心5分鐘。

棄去上清，加入新的培養(yǎng)基重懸，于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

建議1：2傳代。

待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。

收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入專用的淋巴細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5x106~ 1x107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。

小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞研究應(yīng)用

研究

CD4+T細(xì)胞是人體中最重要的T細(xì)胞亞群之一，并且可進(jìn)一步?細(xì)分為更多亞群，其功能的發(fā)揮主要依靠產(chǎn)生多種細(xì)胞因子作用于不同的細(xì)胞，?在保護(hù)機(jī)體免受病原體和腫瘤侵害方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。?

實(shí)驗(yàn)研究：通過分離培養(yǎng)CD4+T細(xì)胞并檢測(cè)其產(chǎn)生的細(xì)胞因子類別以便于在體外研究誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞活化及其引起炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制，從而通過藥物等方法調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞活力以達(dá)到治療疾病的目的。

應(yīng)用

TIL（腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞）療法

?從患者體內(nèi)提取腫瘤組織中的T細(xì)胞，?并在實(shí)驗(yàn)室中擴(kuò)增和改造，?使其能夠更有效地識(shí)別和攻擊癌細(xì)胞，目前已有研究表明通過使用改造后的CD4+T細(xì)胞的TCR療法顯著消除了患者腫瘤。

TCR（T細(xì)胞受體）療法

通過提取患者的CD4+T，?并在其中加入一個(gè)可以表達(dá)T細(xì)胞受體的基因，?使T細(xì)胞產(chǎn)生特異性的T細(xì)胞受體，?從而能夠更加有效的發(fā)揮CD4+T細(xì)胞功能，目前對(duì)于CD4+T細(xì)胞改造的應(yīng)用已取得一定成效。

CAR-T（嵌合體抗原受體T細(xì)胞）療法

?從患者組織中提取T細(xì)胞，?通過基因改造加入一種制造嵌合體抗原受體的基因，?使改造后的T細(xì)胞能夠特異性地識(shí)別和殺傷靶細(xì)胞，雖然目前對(duì)于CAR-T療法的研究以CD8+T細(xì)胞為主，但CD4+T細(xì)胞在CAR-T療法中的作用也越來越受到關(guān)注。