背景簡介

293細胞株插入SV40 T-抗原的溫度敏感基因后產(chǎn)生的高轉(zhuǎn)染效率的衍生株稱為293T。

一、細胞基本屬性
細胞名稱	293T人胚腎細胞（STR鑒定報告）
細胞別稱	Hek293T; HEK-293T; HEK 293T; HEK-293-T; HEK 293 T; 293-T; 293 T; 293T; Human Embryonic Kidney 293T; 293tsA1609neo
種屬來源	人
組織來源	腎
生長特性	貼壁生長
細胞形態(tài)	上皮細胞樣
細胞代數(shù)	10代以內(nèi)
STR位點	Amelogenin:X；CSF1PO:11,12；D13S317:12,14；D16S539:9,13；D18S51:17,18；D21S11:28,30.2；D3S1358:15,16,17；D5S818:8,9；D7S820:11；D8S1179:12,14；FGA:23；PentaD:9,10；PentaE:7,15；TH01:7,9.3；TPOX:11；VWA:16,19
STR鑒定圖片
生物安全等級	1
細胞規(guī)格	1×106cells/T25培養(yǎng)瓶或者1mL凍存管包裝
支原體檢測	無
保藏機構(gòu)	ATCC; CRL-3216 DSMZ; ACC-635；中國典型培養(yǎng)物保藏中心細胞庫
倍增時間	~24-30 hours
培養(yǎng)基	90% DMEM+10% FBS+PS
培養(yǎng)條件	氣相：95%空氣+5%二氧化碳；溫度：37℃
凍存條件	無血清凍存液，液氮儲存
細胞貨期	現(xiàn)貨，1周左右
特別注意	293T細胞貼壁不牢，運輸過程中細胞會有脫落，如細胞脫落，請離心收集，消化后重新鋪瓶
產(chǎn)品貨期	現(xiàn)貨，1周左右
運輸方式	復(fù)蘇發(fā)貨（T25瓶免運輸費用）/  凍存發(fā)貨（需加干冰運輸費用） 順豐快遞
供應(yīng)限制	僅限于科學(xué)研究，絕不可作為動物或人類疾病的治療產(chǎn)品使用
特別說明	以下細胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主
293T人胚腎細胞培養(yǎng)常見問題
1.293T細胞形態(tài)是什么樣的? 293t細胞形態(tài)呈上皮細胞樣，貼壁生長。 2.到貨的293T細胞脫落，如何處理? 293T細胞因為貼壁松散，若購買常溫細胞，收貨時有可能大部分細胞脫離培養(yǎng)瓶壁，顯微鏡下找不到細胞，只能看到肉眼可見的細胞團，是正?，F(xiàn)象。 收到細胞后請先置于培養(yǎng)箱中穩(wěn)定4-6h后再進行下一步處理，不建議放置培養(yǎng)箱過夜后處理。 處理步驟 1.將培養(yǎng)瓶內(nèi)所有培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無菌離心管，1000rpm離心4min收集細胞； 2.去掉上清，用PBS重懸細胞(以手搖離心管的方式重懸，不要用移液槍吹)，將細胞收集到一個離心管中，再次1000rpm離心4min； 3.去掉上清，加入1mL左右0.25%胰酶重懸細胞(還是以手搖離心管的方式混勻，不要吹細胞), 放入培養(yǎng)箱消化2min； 4.消化2min后，加入5mL完全培養(yǎng)基混勻終止消化，用移液槍輕輕吹打細胞懸液，使細胞團分散，1200rpm離心3min； 5.去掉上清，加入6mL左右細胞相應(yīng)的完全培養(yǎng)基混勻，視細胞量決定是1:2傳代還是1:3傳代(由于細胞運輸有損傷，首次傳代建議比平時養(yǎng)密度稍高)； 6.顯微鏡下觀察細胞是否有分散成單顆現(xiàn)象，若有明顯很大的細胞團需要重復(fù)上述步驟二次消化; 7.第二天及時觀察細胞貼壁情況，若貼壁細胞量過多，造成細胞堆積，貼壁24h后再次傳代分瓶，若密度正常則繼續(xù)生長，不建議換液貼壁48h后換液去掉不能貼壁的細胞。 3.293T人胚腎細胞傳代后聚團嚴重? 原因分析 a.胰酶消化操作不當導(dǎo)致細胞聚團。消化過度或吹打過猛導(dǎo)致細胞受傷嚴重，破損的細胞碎片容易粘連聚團。 b.消化時293T細胞融合率太高，成片脫落，將不容易被吹散，容易聚團。 c.鑒于293T細胞貼壁疏松，普通0.25%胰酶消化時間控制10s-40s(不同胰酶牌子消化時間不同);吹打動作輕柔，充分分散;細胞融合率達到80%-90%即可傳代，不可長的太滿。 d.細胞培養(yǎng)基中存在的成分：一些細胞培養(yǎng)基的成分可能促進細胞的聚集，例如含有過多的膠原蛋白或其他黏附蛋白。 e. 細胞質(zhì)粘附不良：有些細胞可能由于細胞表面蛋白或黏附分子的缺失導(dǎo)致粘附能力下降，從而容易聚集在一起。 f 培養(yǎng)條件不當：細胞培養(yǎng)過程中的pH、溫度、氣體條件等因素如果不適當可能會導(dǎo)致細胞聚集。 g. 感染或污染：細胞培養(yǎng)過程中的感染或污染可能導(dǎo)致細胞產(chǎn)生異常反應(yīng)，包括聚集在一起形成團塊。 4.293T人胚腎細胞換了血清批次后聚團嚴重? 原因分析 血清批次間存在差異。293T細胞本身有聚團生長特性，但嚴重聚團可能是由于受到血清里的某些因子刺激。 先用血清試用裝，試用效果好，可購買和血清試用裝批次相同的正裝，有效避免批間差對細胞的影響。 5.293T人胚腎細胞轉(zhuǎn)染病毒后凋亡嚴重？ 在排查了方法步驟和轉(zhuǎn)染試劑，依然沒有改善的情況下，可排查一下轉(zhuǎn)染前的營養(yǎng)體系，尤其是血清批間差帶來的影響。前期培養(yǎng)細胞形態(tài)正常，其實細胞形態(tài)學(xué)只是鑒別細胞是否健康的一個外在指標，還要結(jié)合細胞其它指標對細胞健康進行評定(比如倍增時間，存活率)。 通過更換血清批次，再進行轉(zhuǎn)染實驗并觀察轉(zhuǎn)染后的效果，比較分析出原因。 6.293T人胚腎細胞培養(yǎng)要點 293T人胚腎細胞貼壁性較差，容易飄起來，37℃靜置可重新貼壁。換液時注意不要用力搖晃培養(yǎng)瓶，否則有可能會把細胞搖下來。 293T人胚腎細胞容易消化，消化下來的細胞容易成團，要吹打吹散。否則傳代后細胞會成團生長，不均勻，影響實驗結(jié)果。 當293T人胚腎細胞生長至匯合率達到80~90%需要對細胞進行傳代操作，以擴大細胞數(shù)量，維持細胞良好的生長狀態(tài)。 細胞貼壁松散，操作時應(yīng)輕拿輕放;PBS潤洗時動作應(yīng)緩慢，避免沖走細胞; 細胞傳代第二天可能有輕微聚團現(xiàn)象，再長一天能長開，不建議傳代第二天換液，以免損失細胞。 隨著傳代的次數(shù)增加，293T細胞會出現(xiàn)生長狀態(tài)下降，出現(xiàn)突變等情況。所以要在細胞購進時就進行大量凍存，以保證實驗的穩(wěn)定性和持續(xù)性。 7.293T人胚腎細胞特點 a.細胞貼壁能力比較弱：293T細胞是貼壁細胞，但其貼壁能力比較弱，容易出現(xiàn)明顯的成片脫落現(xiàn)象。比如：運輸?shù)蜏丶罢鹗帯⒃谑覝貤l件下靜置時間過長、添加的培養(yǎng)基或其他試劑溫度過低、培養(yǎng)時細胞密度過高、細胞聚集時未吹散、加液吹打時觸碰了細胞表面等。 若脫落現(xiàn)象不嚴重應(yīng)將細胞盡快放回培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，若出現(xiàn)大片脫落的現(xiàn)象需要收集細胞重新消化吹散再接種。 b.細胞本身偏嗜酸性，培養(yǎng)基消耗較快；293T細胞在略偏酸性的環(huán)境下生長狀態(tài)更好，在培養(yǎng)過程中需要時刻注意培養(yǎng)基的pH值。在細胞密度達到70%以上時，細胞培養(yǎng)基的消耗速度較快，需要時刻觀察并及時換液。 c.細胞生長時聚集成島：293T細胞生長時呈島狀聚集生長，會逐步向外擴散直到完全融合。 d.細胞聚集成團之后很難再吹散：293T細胞傳代過程中一定要注意吹散細胞，同時接種的密度不可過高。密度過高容易使細胞抱團，導(dǎo)致難以再次吹散，會在培養(yǎng)器皿中形成類似于球狀的聚集體貼壁生長。導(dǎo)致即使培養(yǎng)條件合適細胞也難以生長。
二、細胞培養(yǎng)操作
到貨方式	復(fù)蘇細胞/T25瓶運輸
收貨處理	1.收到細胞后，請檢查發(fā)貨培養(yǎng)瓶的狀況，是否有破損、漏液、渾濁等現(xiàn)象。如果有，請立即和我們聯(lián)系；如果沒有，請您用75%酒精消毒細胞瓶外壁，再將其置于37度培養(yǎng)箱靜置4h。 2.靜置后觀察細胞狀態(tài)，在顯微鏡下確認細胞生長狀態(tài)時，最好在低倍鏡（4或5X物鏡）下進行，能準確判斷細胞的傳代密度?？醇毎男螒B(tài)請在10X和20X物鏡下，同時給剛收到的細胞拍照，（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為細胞需要售后時提供收到細胞時細胞狀態(tài)的依據(jù)。拍照反饋給我們。
傳代密度	細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)
傳代方法	1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。 2.加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。 3.按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。 4.將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
到貨方式	凍存細胞/1ml凍存管運輸
收貨處理	1.干冰運輸?shù)募毎截洠垯z查干冰是否完全揮發(fā)，細胞是否解凍，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請及時和我們聯(lián)系。 2.為保證細胞的高存活率，收到產(chǎn)品后，請立即解凍復(fù)蘇細胞，如若不能復(fù)蘇請立即轉(zhuǎn)入液氮凍存。
培養(yǎng)皿/瓶	一管細胞建議接種到6cm培養(yǎng)皿或者T25瓶
復(fù)蘇操作	1.將含有1 mL細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。 2.在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。 3.然后將所有細胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤? cm皿中，加入約4 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。 4.第二天換液并檢查細胞密度。
注意事項	1.運輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細胞，請換用按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞。 2.因運輸問題，部分細胞由于溫度變化及劇烈碰撞死亡破碎形成碎片，是正?，F(xiàn)象。請及時和我們聯(lián)系，告知細胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤回訪直至問題解決。 3. 凍存細胞發(fā)貨2管，客戶先復(fù)蘇一支，若復(fù)蘇失敗及時聯(lián)系我方并在我方指導(dǎo)下復(fù)蘇第二支。 4. 申請售后時請?zhí)峁┘毎肇洉r及反饋售后當天細胞清晰照片及培養(yǎng)信息，建議客戶在細胞傳代培養(yǎng)后，定期拍照、記錄細胞生長狀態(tài)。 5.所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內(nèi)操作，并請注意防護，所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。 6. 細胞在不同實驗室培養(yǎng)由于所使用培養(yǎng)基及血清品牌、個人操作習(xí)慣、培養(yǎng)瓶品牌等諸多培養(yǎng)條件不盡相同，導(dǎo)致細胞培養(yǎng)形態(tài)、生長速度、貼壁情況均可能有所差異，對于此類細胞適應(yīng)環(huán)境生長的行為，不予過度解釋或免費售后。
三、細胞凍存操作
凍存液配方	無血清凍存液，液氮儲存
凍存密度	如果是有要求每管要凍多少細胞，那就用1ml完培重懸后，取部分按平時方法計數(shù)，剩下的細胞按計數(shù)需要的細胞量凍存即可。 如果沒要求，那就按平時，一個皿凍一管。
凍存方法	待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面 T25 瓶為例 1.收集細胞及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，加1 mL血清重懸細胞，進行細胞計數(shù)。 2.根據(jù)細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5x106~1x107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。 3.將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
注意事項	凍存細胞轉(zhuǎn)入液氮后及時復(fù)蘇一管檢查細胞凍存活性，若有異常，及時調(diào)整實驗方案

參考文獻

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細胞：HEK293T cell line

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細胞：Stomach cancer cell lines,HGC-27 and MGC-803 , and 293T

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作者：Wang, L., Ma, X., Chen, Y., Zhang, J., Zhang, J. et al.

細胞：HEK293T and Hep3B cells

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