細(xì)胞體外培養(yǎng)是研究細(xì)胞生物學(xué)和藥物開發(fā)的關(guān)鍵工具之一。然而，有時我們會遇到細(xì)胞生長緩慢的問題，生長緩慢的原因可以歸結(jié)為兩類：外部環(huán)境因素和細(xì)胞自身問題。

細(xì)胞培養(yǎng)外部因素包括細(xì)胞培養(yǎng)基的配方和質(zhì)量問題、培養(yǎng)條件不理想、污染問題，細(xì)胞自身因素包含細(xì)胞的健康狀態(tài)、細(xì)胞密度過高或過低、細(xì)胞老化現(xiàn)象、細(xì)胞特性等等。

很多同學(xué)在培養(yǎng)細(xì)胞過程中會有疑問，為什么我養(yǎng)的細(xì)胞生長速度這么的慢，是我的操作問題，還是培養(yǎng)體系，培養(yǎng)環(huán)境的問題，還是都有問題，其實，有些細(xì)胞本身的生長速度就比較慢些。

下面我們就來探討分析細(xì)胞生長緩慢的可能原因有哪些及相應(yīng)的解決方法。

細(xì)胞生長緩慢的可能原因有哪些

1.細(xì)胞本身生長較慢

細(xì)胞長得慢是細(xì)胞培養(yǎng)過程中比較常見的問題，一般來說，細(xì)胞活力和濃度一直是細(xì)胞健康的標(biāo)志，細(xì)胞長得慢的話，活力和濃度可能都會直線下降。

某些細(xì)胞類型，如Caco-2(人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞)和LNCaP clone FGC(人前列腺癌細(xì)胞)，因其固有的生長特性，生長速度較慢，傳代周期較長，導(dǎo)致它們的培養(yǎng)過程相對復(fù)雜且耗時。

以LNCaP clone FGC細(xì)胞為例，這一細(xì)胞不僅生長緩慢，還容易導(dǎo)致培養(yǎng)基迅速變酸。且該細(xì)胞生長過程中并不形成均勻的單層，而是傾向于形成集落。因此，傳代后的48h內(nèi)不應(yīng)擾動。LNCaP clone FGC細(xì)胞在進(jìn)行換液處理時，我們必須格外小心，避免對細(xì)胞造成擾動，確保集落能夠穩(wěn)定形成并維持細(xì)胞的正常生長。

總之，在培養(yǎng)這類生長緩慢的細(xì)胞時，我們必須密切關(guān)注細(xì)胞的生長狀態(tài)，并根據(jù)需要適時調(diào)整培養(yǎng)條件，以提供一個最適宜的細(xì)胞生長環(huán)境。

細(xì)胞本身狀態(tài)改變，如衰老等

當(dāng)然如果培養(yǎng)細(xì)胞是原代的話，生長速度是比較緩慢的，如果沒有及時換液，營養(yǎng)成分不夠，細(xì)胞也會生長緩慢。用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣，要保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈等。

2.細(xì)胞生長密度的影響

細(xì)胞生長密度是影響細(xì)胞生長的關(guān)鍵因素之一。當(dāng)密度過高，細(xì)胞會競爭有限的營養(yǎng)和空間而導(dǎo)致細(xì)胞生長速度變慢。密度過低可能導(dǎo)致細(xì)胞間信號傳遞受阻、代謝活動異常及細(xì)胞群居效應(yīng)減弱，不利于細(xì)胞的生長。

以HL-60(人原髓細(xì)胞白血病細(xì)胞)為例，它在高密度環(huán)境下生長更佳，而在低密度下則狀態(tài)不佳。當(dāng)HL-60細(xì)胞傳代后生長速度緩慢且狀態(tài)不佳時，可以嘗試豎直放置培養(yǎng)瓶，提高細(xì)胞的局部密度。隨著細(xì)胞密度的增加，其生長狀態(tài)可能會改善。然而，并非所有細(xì)胞都像HL-60細(xì)胞偏愛高密度培養(yǎng)，RAW264.7(小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞)便是一個典型的反例，它們生長迅速，但一旦超過3天未傳代，就會開始分化，導(dǎo)致形態(tài)、功能改變，增殖速度降低。

因此，為了確保細(xì)胞能夠正常增殖和維持良好的生長狀態(tài)，我們需要定期觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，及時換液或傳代，優(yōu)化培養(yǎng)條件。

3.培養(yǎng)基的選擇與適配

在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基的選擇與適配對細(xì)胞生長至關(guān)重要。

對于C127 (小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞) 、293T (人胚腎細(xì)胞) 和COS-7 (非洲綠猴SV40轉(zhuǎn)化的腎細(xì)胞)等細(xì)胞，通常建議使用DMEM高糖培養(yǎng)基(葡萄糖濃度4500 mg/L)。低糖培養(yǎng)基可能會限制細(xì)胞生長，甚至可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。對于特定類型的細(xì)胞，如間充質(zhì)干細(xì)胞，使用通用完全培養(yǎng)基可能因缺乏生長因子(如TGF-β、FGF2等)而限制細(xì)胞增殖[1]，因此，對于這類細(xì)胞，一般建議使用專為它們配制的用完全培養(yǎng)基。血清是細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)的重要來源，在選擇培養(yǎng)基時，必須嚴(yán)格篩選血清產(chǎn)品，以確保細(xì)胞培養(yǎng)的穩(wěn)定性和可靠性。此外，換液對于維持細(xì)胞營養(yǎng)充足同樣重要，一般建議每2-3天換液一次，以防止?fàn)I養(yǎng)成分耗盡和代謝廢物積累，保護(hù)細(xì)胞免受損害。

除了營養(yǎng)成分和生長因子外，培養(yǎng)基酸堿度(pH值)也是影響細(xì)胞生長的重要因素。大多數(shù)細(xì)胞在pH值7.2至7.4范圍內(nèi)的環(huán)境生長最佳。但需注意不同類型細(xì)胞對pH值的要求存在差異。原代細(xì)胞培養(yǎng)對pH值的波動較為敏感，而細(xì)胞系則具有更強的適應(yīng)性。為了監(jiān)測培養(yǎng)基的pH值變化，通常會在培養(yǎng)基中加入酚紅作為指示劑。若觀察到培養(yǎng)基顏色發(fā)生明顯的變化，如培養(yǎng)基顏色變黃，可以采取換液等相應(yīng)措施，以確保細(xì)胞正常生長。

特別需要注意的是，培養(yǎng)基一旦開封，應(yīng)盡快使用完，以防止保存不當(dāng)或品質(zhì)下降。若不能短時間用盡，建議進(jìn)行分裝儲存，避免反復(fù)預(yù)熱。在使用開封后的培養(yǎng)基時，如果發(fā)現(xiàn)其顏色與未開封的培養(yǎng)基相比發(fā)生明顯變化，應(yīng)先排查原因，確認(rèn)是否由微生物污染所引起。若排除了污染的可能性，則可能是培養(yǎng)基緩沖體系發(fā)生變化導(dǎo)致pH值波動。此時，建議將培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中放置一段時間，讓其達(dá)到新的平衡狀態(tài)后再使用。

為了確保細(xì)胞的正常生長，建議選擇與細(xì)胞類型相適配的培養(yǎng)基，并參考細(xì)胞培養(yǎng)說明書進(jìn)行相關(guān)的培養(yǎng)操作。

4.實驗操作的影響

在實驗操作過程中，多個因素都可能影響細(xì)胞的生長。以下是對這幾個關(guān)鍵因素的詳細(xì)闡述：

胰酶消化

胰酶消化時間需適中。消化時間過長會損傷細(xì)胞，過短則可能導(dǎo)致細(xì)胞消化不充分，聚團(tuán)、不易分離，進(jìn)而影響細(xì)胞的貼壁和增殖能力。因此，應(yīng)優(yōu)化消化時間，注意鏡下消化狀態(tài)，以確保細(xì)胞損傷最小化，從而保障細(xì)胞的正常生長。

細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

細(xì)胞在凍存或復(fù)蘇過程中若受到損傷，如凍存液不合適、凍存量較少、保存不當(dāng)、復(fù)蘇時解凍或放置太久等，都可能導(dǎo)致復(fù)蘇后的細(xì)胞生長緩慢。因此，我們應(yīng)嚴(yán)格按照規(guī)范進(jìn)行操作，以減少細(xì)胞損傷。首次凍存某個細(xì)胞時，可以做凍存測試，確保復(fù)蘇后的細(xì)胞能夠正常生長。

懸浮振蕩培養(yǎng)

對于懸浮振蕩培養(yǎng)的細(xì)胞，搖床的振幅與轉(zhuǎn)速控制至關(guān)重要。我們需要根據(jù)細(xì)胞類型和生長特性，調(diào)整至適宜的參數(shù)，以確保細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下能夠正常增殖。

無菌操作規(guī)范

細(xì)胞污染是多方面的原因，如支原體，細(xì)菌，真菌等，一方面要嚴(yán)格無菌操作技術(shù)、保持清潔的環(huán)境，，嚴(yán)格的無菌操作對防止微生物污染至關(guān)重要，我們必須使用無菌試劑和培養(yǎng)基，并定期清潔和消毒培養(yǎng)環(huán)境。一旦發(fā)現(xiàn)污染，應(yīng)立即采取措施進(jìn)行全面消殺。

因此，為確保細(xì)胞正常生長，我們需要從多個環(huán)節(jié)入手，不斷優(yōu)化實驗操作并嚴(yán)格遵守?zé)o菌規(guī)范。

5.培養(yǎng)環(huán)境的影響

細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境對細(xì)胞生長至關(guān)重要，不適宜的環(huán)境可能導(dǎo)致細(xì)胞生長變慢，甚至死亡。關(guān)鍵環(huán)境因素包括：溫度、二氧化碳和氧氣等。通常，大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)溫度維持在37℃左右，過大波動將直接影響細(xì)胞生長狀態(tài);二氧化碳在維持培養(yǎng)液pH穩(wěn)定方面起關(guān)鍵作用，濃度過低或過高均不利于細(xì)胞生長;同時，氧氣也是細(xì)胞代謝關(guān)鍵要素，培養(yǎng)基溶氧不足會顯著影響細(xì)胞的生長和存活。

因此，我們必須定期檢查培養(yǎng)箱的溫度和氣體控制設(shè)備，確保環(huán)境因素處于最適宜水平，以保障細(xì)胞的正常生長。

綜上所述，當(dāng)細(xì)胞生長出現(xiàn)緩慢的問題時，我們需要系統(tǒng)地排查原因，并結(jié)合具體的實驗情況，綜合考慮細(xì)胞本身的特性、細(xì)胞密度、培養(yǎng)基以及操作細(xì)節(jié)，進(jìn)行分析和相應(yīng)調(diào)整。

以上是關(guān)于細(xì)胞生長緩慢的常見原因和解決方法詳解，細(xì)胞培養(yǎng)中生長緩慢的原因包括外部環(huán)境因素和細(xì)胞自身問題。為了解決這些問題，我們需要確保優(yōu)質(zhì)的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，注意細(xì)胞培養(yǎng)物的無菌狀態(tài)，及時更換新鮮的細(xì)胞，控制細(xì)胞密度和關(guān)注細(xì)胞的健康狀態(tài)。通過采取這些措施，我們可以提高細(xì)胞培養(yǎng)的成功率和細(xì)胞生長的速度。

參考文獻(xiàn)

[1]Chu DT, Phuong TNT, Tien NLB, et al. An Update on the Progress of Isolation, Culture, Storage, and Clinical Application of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem/Stromal Cells. International Journal of Molecular Sciences. 2020 Jan 21;21(3):708. doi: 10.3390/ijms21030708. PMID: 31973182; PMCID: PMC7037097.