SH-SY5Y人骨髓神經(jīng)母細胞瘤細胞背景簡介

人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞系被廣泛用于神經(jīng)系統(tǒng)研究，該細胞系是SK-N-SH細胞系的亞系，于1970年從4歲女性轉(zhuǎn)移性神經(jīng)母細胞瘤的骨髓穿刺活檢中建立，該細胞系包括兩種形態(tài)上不同的細胞類型，一種為成神經(jīng)細胞，另一種為上皮樣細胞。SH-SY是來源于SH-N-SH的成神經(jīng)細胞亞系，SH-SY5是SH-SY的亞系，SH-SY5Y是SH-SY5的亞系，經(jīng)歷了三輪克隆選擇最終形成。

sh-sy5y cells是人骨髓神經(jīng)母細胞瘤細胞株，它衍生于人的神經(jīng)母細胞瘤細胞系SK2N 2SH。這些細胞具有神經(jīng)突樣的細胞質(zhì)突起，是研究神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病常用的動物模型。SH-SY5Y細胞能夠表達GABA受體、谷氨酸受體等功能的亞型，并參與多種神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放。在臨床醫(yī)學中，SHSY5Y常用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制及治療的研究，如阿爾茨海默病、癲癇等。此外，它還可以作為一種工具來探索其他藥物的作用機制以及其對正常生理功能的影響。

sh-sy5y cells衍生于人的神經(jīng)母細胞瘤細胞系SK2N 2SH ,它具有表達兒茶酚胺能神經(jīng)元特有的酪氨酸羥化酶、多巴胺2B2羥化酶和多巴胺轉(zhuǎn)運體, 該細胞系被廣泛運用于PD 發(fā)病機制的研究。

SH-SY5Y人骨髓神經(jīng)母細胞瘤細胞形態(tài)特征

SH-SY5Y人神經(jīng)母細胞瘤細胞產(chǎn)品信息

細胞名稱：SH-SY5Y，人神經(jīng)母細胞瘤細胞

細胞別稱：SHSY5Y; SHSY-5Y; SH-Sy5y; SK-SH-SY5Y; SY5Y;人神經(jīng)母細胞瘤細胞

種屬來源：人

年齡性別：女;4歲

組織來源：腦神經(jīng)母細胞瘤，轉(zhuǎn)移部位骨髓

生長特性：半貼壁生長(貼壁和懸浮同時存在)

細胞形態(tài)：上皮細胞樣

STR位點信息：Amelogenin：X;CSF1PO：11;D13S317：11;D16S539：8，13;D18S51：13，16;D19S433：13，14;D21S11：31，31.2;D2S1338：17，19;D3S1358：15，16;D5S818：12;D7S820：7，10;D8S1179：15;FGA：23.2，24;TH01：7，10;TPOX：8，11;vWA：14，18;

保藏機構(gòu)：ATCC; CRL-2266 DSMZ; ACC-209 ECACC; 94030304 ;中國典型培養(yǎng)物保藏中心細胞庫

培養(yǎng)基：43%MEM+43%F12+10%FBS+1% MEM NEAA(非必需氨基酸)+1%丙酮酸鈉+1% GlutaMAX-1+PS

培養(yǎng)條件：氣相：95%空氣+5%二氧化碳;溫度：37℃

凍存條件：無血清凍存液，液氮儲存

倍增時間：~48-72 hours

抗原表達情況：Blood Type A; Rh+

染色體：81~92

sh-sy5y細胞系特征

1. 成團簇的形式生長

2. 由于SH-SY5Y細胞是三維團簇的方式生長，復蘇和傳代后會重新附著為三維島(會有一些不會重新附著的簇)。生長最終會從島嶼狀慢慢擴散開來，隨著時間的推移，細胞會緩慢變成單層，這個時候細胞基本處于對數(shù)生長期。

3. SH-SY5Y細胞是一種本身生長緩慢的細胞，當細胞培養(yǎng)至細胞 70~80% 的匯合度，即可進行分瓶處理，一般T25培養(yǎng)瓶建議1:2傳代，每周可傳代2~3次，如果細胞生長速度比正常的時候更慢，可以適當提高血清到20%有利于促進生長。

4. SH-SY5Y細胞在復蘇、傳代后，細胞會有一些漂浮狀態(tài)，這些漂浮細胞是正?，F(xiàn)象，可以視為混合的貼壁和懸浮細胞系。一般復蘇、傳代培養(yǎng)3天后漂浮細胞會再繼續(xù)粘附貼壁。直到生長從島嶼擴散開來并且在培養(yǎng)瓶內(nèi)伸展開，通常在進行換液的時候我們會補加培養(yǎng)基，如果一定要全換液，可以通過離心收集懸浮細胞以1000轉(zhuǎn)5min，并將懸浮細胞接種到新培養(yǎng)瓶。

5. SH-SY5Y細胞密度低時，生長緩慢，接種密度建議啟動接種密度：8.0×104至 1.5× 105活細胞/cm2為宜，繼代培養(yǎng)的接種密度：4.0 × 104至 1.0×105 活細胞/cm2。

sh-sy5y細胞培養(yǎng)方法

細胞培養(yǎng)的基本條件

實驗室條件

1. 無菌環(huán)境：無菌室包括更衣室，緩沖間，風淋間，操作間

2. 儀器設(shè)備：超凈工作臺-操作平臺、CO2 培養(yǎng)箱-細胞生長的環(huán)境、倒置顯微鏡-觀察細胞、離心機-離心收集細胞、冰箱-放置培養(yǎng)基等試劑、水浴鍋-復蘇細胞、真空泵-收集廢液、滅菌鍋-滅菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-凍存細胞、純水儀-制備一級水

3. 器材耗材：玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、巴士管、離心管、移液槍、槍頭(白色 0-10ul;黃色 20-200ul;藍色 100-1000ul)、濾器，吸管，多孔培養(yǎng)皿、6cm 皿、10cm 皿，培養(yǎng)瓶等。

4. 試劑：MEM、F12、NEAA(非必需氨基酸)、丙酮酸鈉、GlutaMAX-1、FBS胎牛血清、雙抗、胰酶(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)、pbs

操作者工作范疇

1. 無菌操作：洗手，戴手套，穿實驗服，常噴 75%酒精

SH-SY5Y人神經(jīng)母細胞瘤細胞復蘇方法

1.準備：紫外線照臺 30min，提前打開水浴鍋設(shè)置 37℃，培養(yǎng)基臨用前放水浴箱里溫育20 分鐘(或者放在超凈工作臺常溫放 30min)。在操作臺上擺放好物品，左邊放完全培養(yǎng)液，1mL 槍頭(已滅菌)，培養(yǎng)皿，右上角放廢液缸，1mL 移液槍，3mL 巴氏管。檢查離心機，廢液泵。

2)待水浴鍋溫度達到 37℃時，戴上手套和護目鏡，從-196℃液氮罐中取出凍存管，將含有1 mL細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，同時不斷輕輕搖動凍存管，盡量保證凍存管內(nèi)細胞 1min 內(nèi)融化，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻， 移入離心機中 100rpm 離心 3min，以 75%酒精噴凍存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。

3)用 3mL 巴氏管取 5mL 新鮮培養(yǎng)基到一個新的 6cm 培養(yǎng)皿中，(若離心后細胞量較多，可取 12mL 新鮮培養(yǎng)基到一個新的 10cm 培養(yǎng)皿中)，標記日期、所用培養(yǎng)基名稱和細胞名稱。

4)用廢液泵(吸力不要太大)取一個黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取 1mL 新鮮培養(yǎng)基重懸細胞后(充分混勻)，將細胞懸液加入到培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺上以畫“8”字法鋪勻細胞(一般培養(yǎng)皿在臺子上畫 30 個 8 字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測是否鋪勻細胞。

5)確定細胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入 CO2 培養(yǎng)箱過夜。(盡量平直放入不要晃動)，第二天換液并檢查細胞密度。

SH-SY5Y人神經(jīng)母細胞瘤細胞傳代方法

1) 準備工作：紫外線照臺 30min，準備好細胞培養(yǎng)所需試劑物品：培養(yǎng)液，胰酶，PBS(試劑提前拿出 37℃預(yù)熱或者常溫放置半小時以上);傳代用培養(yǎng)皿，巴士管，離心管(已滅菌)，槍頭(已滅菌)，移液槍，廢液缸。檢查離心機，廢液泵;

2)從培養(yǎng)箱拿出細胞，在顯微鏡下觀察細胞密度和細胞狀態(tài)，當細胞狀態(tài)良好，且密度達到 85%左右的時候即可進行傳代;

4)打開廢液泵，用廢液泵吸頭(吸力不要太大)取一個藍色槍頭吸走上清廢液，用巴士管取 4ml 不含鈣、鎂離子的1xPBS(6cm 皿)到細胞培養(yǎng)皿中(若是 10cm 皿則取 8ml 1xPBS)，輕輕晃動以清洗細胞表面1-2次;

5)用廢液泵吸走 PBS 廢液，加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)于培養(yǎng)瓶中，拿起培養(yǎng)皿輕輕轉(zhuǎn)動以便胰酶浸泡到每個細胞，消化 1-3min(根據(jù)細胞貼壁情況判斷，貼壁較牢的消化時間長一點或者放入 CO2 培養(yǎng)箱中消化幾分鐘)后，在顯微鏡下觀察細胞是否變圓變亮，一旦發(fā)現(xiàn)大量細胞胞質(zhì)回縮，細胞間隙增大，即將脫離培養(yǎng)皿底，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

6)用 1ml 移液槍輕柔吹打，保證培養(yǎng)皿底的每個角落都吹打到，邊緣處也不能忽略(吹打時盡量避免產(chǎn)生氣泡，因其對細胞有傷害;需輕柔吹打，用力吹打?qū)毎灿袀?，把培養(yǎng)瓶中所有細胞懸液用吸 1ml 移液槍移入無菌離心管中。

7)將裝有細胞懸液的離心管放入離心機中(配平)，1000 轉(zhuǎn)離心 3-5min，用廢液泵取一個黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取 1-2mL 新鮮培養(yǎng)基重懸細胞后(充分混勻)，將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺上以畫“8”字法鋪勻細胞(一般培養(yǎng)皿在臺子上畫 30 個 8 字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測是否鋪勻細胞。

8) 確定細胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入 CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(盡量平直放入不要晃動)。第二天再觀察細胞密度。

SH-SY5Y人神經(jīng)母細胞瘤細胞傳代小貼士

1. 培養(yǎng)該SH-SY5Y細胞要有耐心，不能看見抱團或不貼壁，就急著處理或頻繁觀察，給細胞穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境和時間成長。

2. SH-SY5Y細胞消化時，肉眼很快會發(fā)現(xiàn)細胞脫落，不要著急終止消化，因細胞團塊雖然脫落，但細胞之間的蛋白還緊密連接。所以稀釋消化液，延長消化時間很關(guān)鍵。

3. 根據(jù)SH-SY5Y細胞特點，一定要正確判斷細胞密度，如感覺細胞生長緩慢，5-6天還不能傳代，可消化下來計數(shù)判斷。該細胞大部分呈貼壁生長，根據(jù)情況，如懸浮量少，可不回收。

SH-SY5Y人神經(jīng)母細胞瘤細胞凍存準備

1) 準備工作：紫外線照臺 30min，準備好細胞培養(yǎng)所需試劑物品：培養(yǎng)液，胰酶，PBS(試劑提前拿出 37℃預(yù)熱或者常溫放置半小時以上);傳代用培養(yǎng)皿，巴士管，離心管(已滅菌)，槍頭(已滅菌)，移液槍，廢液缸。檢查離心機，廢液泵;

2)從培養(yǎng)箱拿出細胞，在顯微鏡下觀察細胞密度和細胞狀態(tài)，待細胞生長狀態(tài)良好且存活率高的狀態(tài)下，細胞密度達 80–90%時，可進行細胞凍存操作，以T25 瓶為例

SH-SY5Y人神經(jīng)母細胞瘤細胞凍存方法

a.收集細胞及細胞培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶內(nèi)所有培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無菌離心管，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數(shù)。

b.根據(jù)細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液， 在細胞凍存管上貼上細胞標簽(細胞標簽上包含：細胞名稱、凍存日期、培養(yǎng)用的 培養(yǎng)基)。

c.將凍存管入庫到-80 度凍存盒里，放置 24 小時后，即可移入液氮中保存，標記好入庫位置和凍存日期。

SH-SY5Y細胞凍存小貼士

1.凍存管在液氮長期保存過程中難免滲入液氮，取出細胞時震動不要過大，水浴前一定要觀察管內(nèi)是否存在液氮，若有液氮建議靜置一會待液氮完全蒸發(fā)后再水??；

2.水浴時可以使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源，可以降低管蓋縫隙滲入水導致污染的概率；

3.水浴至剩米粒大小時及時終止水浴，避免過度水浴或水浴時間不足；

4.建議水浴完成后直接在離心管內(nèi)離心細胞，避免再次轉(zhuǎn)移細胞；

5.復蘇后的SH-SY5Y細胞比較脆弱，吹打和轉(zhuǎn)移細胞時盡量輕柔，復蘇24h后換液去除死亡細胞；

人神經(jīng)母細胞瘤細胞SHSY5Y培養(yǎng)建議

1. 貼壁弱，消化時間短，注意控制消化時間;

2. 細胞傳代容易成團聚集，可以通過控制細胞密度不超過80%，當密度到達或超過80%及時傳代，傳代時切勿暴力吹打，避免對細胞造成機械刺激，同時注意盡量吹散細胞;

3. 細胞生長偏慢，注意控制細胞密度不要過低;細胞密度過高時及時傳代，避免培養(yǎng)基變黃導致細胞脫落或者狀態(tài)變差。

4. MEM/F12以及DMEM/F12都可以培養(yǎng)SH-SY5Y細胞，但不同培養(yǎng)基培養(yǎng)之后會有部分形態(tài)差異;

5. SH-SY5Y細胞是成簇生長，飽和度高，其表現(xiàn)會是鏡下觀察密度低，但每團細胞簇密度大，可以根據(jù)培養(yǎng)基顏色進行換液;

SH-SY5Y人神經(jīng)母細胞瘤細胞培養(yǎng)常見問題

SH-SY5Y細胞收到貨細胞皺縮脫落怎么處理？

常溫運輸過程中，sh-sy5y cells不免受到震蕩和溫度變化的影響，出現(xiàn)皺縮、聚團甚至脫落的現(xiàn)象。遇到這種情況，不用緊張，只要正確處理，細胞就能恢復正常生長。

常溫細胞收貨后，把sh-sy5y cells放進細胞培養(yǎng)箱靜置4小時即可。

脫落后的細胞通常聚團漂浮，通過離心將漂浮的細胞團收集起來，在離心管里進行胰酶消化后重新鋪板即可。

貼壁細胞常規(guī)方法消化下來，和處理好的脫落細胞合并，混勻后鋪板。

1.SH-SY5Y脫落處理步驟

a. 1000rpm(約250g)4min離心收集細胞，去除舊培養(yǎng)基;

b. PBS 重懸細胞，再次 1000rpm(約250g)4min離心，去除PBS;

c. 加入 1mL左右 0.25%胰酶重懸細胞，吹打1-2下吹起沉淀即可;

d. 放入細胞培養(yǎng)箱約 5-8min;

e. 用移液槍輕輕吹打細胞懸液，使細胞團分散;

f. 迅速加入 3-5mL含血清的培養(yǎng)基混勻以終止消化;

g. 1000rpm(約250g)4min離心，去除胰酶;

h. 加入新鮮培養(yǎng)基按合適比例接入無菌培養(yǎng)器皿中;

2.SH-SY5Y細胞復蘇后成團，不貼壁，不能平鋪皿底？

復蘇后，鏡下觀察會有部分成團，不要著急吹打分散，因為細胞剛復蘇，比較脆弱。輕柔吹勻，即可放入培養(yǎng)箱，放入后不要再移動。

復蘇第一天，如圖貼壁細胞抱團貼壁，且部分貼壁部分飄起的大細胞團。這時你要觀察細胞的活率，看看如死細胞較多，可再放置一天后處理?？筛鶕?jù)情況補液，不可直接換液。

3.SH-SY5Y細胞非常敏感，在受到溫度、化學或物理刺激后容易出現(xiàn)成團現(xiàn)象？

SH-SY5Y細胞培養(yǎng)時，貼壁細胞和懸浮細胞同時存在，貼壁細胞呈上皮樣，有短觸角延伸出來，傾向于成簇生長，容易成團。

懸浮細胞過多：SH-SY5Y細胞生長時有少量懸浮細胞，是正常現(xiàn)象。 如果出現(xiàn)大量懸浮的細胞，就需要引起注意了。

處理方法：換液時將懸浮細胞離心收集，新鮮培養(yǎng)基重懸后接種回原瓶/原皿。當貼壁細胞生長狀態(tài)良好、密度適中時，可以舍棄懸浮細胞。

成團嚴重：SH-SY5Y細胞非常敏感，在受到溫度、化學或物理刺激后容易出現(xiàn)成團現(xiàn)象。一個視野下，有少量成團現(xiàn)象，無需特殊處理。成團幾乎沒有鋪展開的細胞時，就需要按以下方法特殊處理一下了。

成團較嚴重的SH-SY5Y細胞處理方法

方法1：低密度接種，用0.125%的低濃度胰蛋白酶消化細胞(時間不超過5min)，按1：6比例傳代接種，并換新的培養(yǎng)器皿。 延長換液時間，3天換液一次，防止細胞脫落。

方法2：使用多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)器皿，以加快細胞貼壁速度，降低細胞聚集成團的幾率。

方法3：重新鋪板，并更換新配制的培養(yǎng)基，并加大血清比例(不超過20%)

方法4：接種時，減少培養(yǎng)基量(如T25加3mL)以加快細胞貼壁速度，等待細胞貼壁后(約8-12小時)，再補加培養(yǎng)基。

預(yù)防成團的方法

1 控制細胞密度不超過80%，當密度到達或超過80%及時傳代;傳代時切勿暴力吹打，避免對細胞造成機械刺激

2 使用質(zhì)量好的細胞培養(yǎng)基和胎牛血清，減少內(nèi)毒素等有害物質(zhì)對細胞的刺激

3 請勿頻繁把細胞從培養(yǎng)箱拿出，氣溫低時需開暖氣維持細胞房溫度;使用PBS、培養(yǎng)基前37度預(yù)熱，以避免溫差對細胞造成刺激

4.SH-SY5Y細胞消化時間多久?

根據(jù)貼壁時間，培養(yǎng)箱靜置消化5-8分鐘，SH-SY5Y細胞易成團。

5.培養(yǎng)過程中SH-SY5Y細胞碎片較多怎么處理?

a.細胞內(nèi)的黑色顆粒是細胞外分泌泡及細胞器折光，這個屬于細胞自身特性，無法清除也無法改變，大部分細胞都會有這種現(xiàn)象，只是不同細胞顆粒多少有區(qū)別，細胞培養(yǎng)體系不適應(yīng)、營養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導致細胞內(nèi)顆粒增加，建議使用合適的培養(yǎng)條件。

b.細胞外的黑色顆粒大部分是細胞碎片和細胞代謝產(chǎn)物，可以先吸走培養(yǎng)基后用PBS潤洗清除，再加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。潤洗不能清除的可以換液清洗后等SH-SY5Y細胞密度70-80%左右消化處理細胞，消化完成后加完全培養(yǎng)基終止消化，混勻細胞，收集細胞懸液900-1000rpm離心3min，棄上清。再加5ml PBS重懸細胞，再離心后，用完全培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時碎片比較少，傳代時可以省略PBS重懸的步驟;如果碎片很多，建議PBS多洗幾次。

SH-SY5Y人神經(jīng)母細胞瘤細胞特點

1. 細胞貼壁較弱

細胞貼壁比較弱，因此在遇到運輸?shù)蜏丶罢鹗?、室溫靜置太長時間、添加的培養(yǎng)基或其他試劑過冷、密度較高、聚集未吹散、加液吹打到細胞面等情況時會出現(xiàn)明顯的成片脫落現(xiàn)象，此時若脫落現(xiàn)象不嚴重應(yīng)盡快放回培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，若呈大片脫落的情況時需要收集細胞重新消化吹散并接種;建議使用經(jīng)過包被或者高貼壁培養(yǎng)瓶培養(yǎng)細胞，盡量避免接觸低溫或密度過高;

2. 細胞本身偏嗜酸性，消耗培養(yǎng)基較快

有細胞在略微偏酸性的環(huán)境下生長狀態(tài)會比偏堿性的好，注意培養(yǎng)基pH控制;細胞密度達到70%以上時，培養(yǎng)基消耗會很快，主意及時觀察并換液;

3. 細胞生長到完全匯合時間較長

細胞呈島狀生長，生長是逐漸向外發(fā)射狀增多，最終生長成片，但仍會有較多細胞間間隙;

4. 細胞聚團后很難再吹散

細胞傳代過程中一定要注意吹散細胞，接種密度不要過高，否則接種后細胞聚團將很難再吹散，會形成類似神經(jīng)球的聚集體貼壁生長，培養(yǎng)條件合適的情況下細胞會逐漸攤開生長，但若培養(yǎng)條件無法有效促進細胞貼壁，可能會長時間呈球狀增殖;

5.生長異常緩慢

當SH-SY5Y細胞培養(yǎng)一周都無法傳代時，可以將細胞消化下來，接種到更小的容器中，人為增加細胞密度，從而促進細胞生長。平時傳代時也要注意接種密度不能太低。

6.能否使用DMEM/F12

MEM/F12和DMEM/F12都可以培養(yǎng)SH-SY5Y細胞培養(yǎng)，并且都有相應(yīng)的文獻支持。但這兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)出來的形態(tài)會有細微差異。 另外，使用品質(zhì)好的胎牛血清將極大改善細胞生長狀態(tài)。

SH-SY5Y人神經(jīng)母細胞瘤細胞特性

神經(jīng)母細胞瘤呈現(xiàn)為藍染的小圓形細胞，菊花形排列。腫瘤細胞圍繞神經(jīng)氈(neuropil)呈菊花形排列，與其他的腫瘤(如視神經(jīng)母細胞瘤)圍繞血管呈菊花形排列有所不同。其他還有一些神經(jīng)母細胞瘤所特異的免疫組化染色，用以與其他腫瘤(尤因肉瘤，淋巴瘤等)進行鑒別診斷。

SH-SY5Y細胞轉(zhuǎn)染操作步驟

SH-SY5Y細胞是神經(jīng)母細胞瘤細胞系中常用的模型系統(tǒng)，廣泛用于神經(jīng)生物學和神經(jīng)藥理學研究。轉(zhuǎn)染SH-SY5Y 細胞是一項重要的實驗技術(shù)，在基因功能研究、蛋白表達和定量分析等方面扮演著關(guān)鍵角色。然而，由于SH-SY5Y細胞的特殊性質(zhì)，使用傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染方法可能會遇到一些困難。以下介紹一種優(yōu)化的SH-SY5Y 細胞轉(zhuǎn)染方法，并詳細描述每個步驟。

材料與試劑

SH-SY5Y細胞系：可從Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences或其他來源獲得。

細胞培養(yǎng)基：Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)/F12混合培養(yǎng)基。

熱穩(wěn)定型胰酶：用于細胞的傳代與分離。

轉(zhuǎn)染試劑：例如，聚乙烯亞胺(PEI)、脂質(zhì)體等。

目標基因的質(zhì)粒DNA或siRNA：用于轉(zhuǎn)染和表達。

Opti-MEM：用于稀釋轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒。

準備SH-SY5Y細胞

1. 獲得SH-SY5Y細胞系并進行培養(yǎng)。

2. 在T25細胞培養(yǎng)瓶中分別加入10 ml完整的MEM/F12培養(yǎng)基及10%胎牛血清(FBS)。

3. 將SH-SY5Y細胞從細胞凍存管中復蘇，并將細胞傳遞至培養(yǎng)瓶中。

4. 在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞，直至細胞達到80-90%的密度。

轉(zhuǎn)染前的預(yù)處理

1. 轉(zhuǎn)染前用DMEM/F12培養(yǎng)基含10% FBS對SH-SY5Y細胞進行預(yù)處理。

2. 將細胞培養(yǎng)至80-90%的密度。

3. 用1X PBS洗滌細胞2次，去除細胞內(nèi)的殘留培養(yǎng)基。

轉(zhuǎn)染操作

1. 根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑的使用說明，將轉(zhuǎn)染試劑稀釋至合適的濃度，如使用PEI轉(zhuǎn)染，可在Opti-MEM中稀釋PEI至最終濃度。

2. 在另一個離心管中將質(zhì)粒DNA或siRNA按照使用的量稀釋至合適體積，并在Opti-MEM中混合均勻。

轉(zhuǎn)染操作步驟

1. 向細胞中加入預(yù)先稀釋好的轉(zhuǎn)染試劑，注意不要形成氣泡并避免細胞過度干擾。

2. 輕輕震蕩培養(yǎng)瓶，使轉(zhuǎn)染試劑均勻分布。

3. 將稀釋好的質(zhì)粒DNA或siRNA加入到培養(yǎng)基中，與轉(zhuǎn)染試劑充分混合，避免形成沉淀。

4. 震蕩培養(yǎng)瓶并置于37℃的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

5. 根據(jù)研究需求，在48-72小時后進行下一步實驗(如蛋白表達、基因敲除等)。

SH-SY5Y人神經(jīng)母細胞瘤細胞應(yīng)用

SH-SY5Y細胞的神經(jīng)分化與神經(jīng)退行性疾病的應(yīng)用

SH-SY5Y細胞可以制備成未分化和分化兩種形式，兩種SH-SY5Y細胞都被用于神經(jīng)科學領(lǐng)域的體外實驗研究。在未分化狀態(tài)下，SH-SY5Y細胞不能完全表現(xiàn)出原代神經(jīng)元的某些特征。通過向細胞培養(yǎng)物中添加特定化合物，神經(jīng)母細胞瘤細胞可以分化為更成熟的神經(jīng)元樣細胞，表現(xiàn)出膽堿能、腎上腺素能或多巴胺能表型。

完全分化的SH-SY5Y神經(jīng)細胞比其未分化的前體細胞更接近于體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的成熟人類神經(jīng)元。此外，SH-SY5Y細胞可以進行基因遺傳操作，包括基于轉(zhuǎn)基因的基因敲除或病毒誘導地過表達，因此適合研究與疾病相關(guān)的基因功能。本文闡述SH-SY5Y細胞系的神經(jīng)分化方法，SH-SY5Y細胞在神經(jīng)退行性疾病，尤其在帕金森病、阿爾茨海默病等實驗研究中的應(yīng)用。

SH-SY5Y細胞的神經(jīng)分化

未分化的SH-SY5Y細胞形態(tài)特征為神經(jīng)母細胞樣、未極化的胞體，突起少而截斷。這些細胞傾向于成簇生長，并可能形成團塊。未分化的SH-SY5Y細胞持續(xù)增殖，表達不成熟的神經(jīng)元標記，缺乏成熟的神經(jīng)元標記。

SH-SY5Y細胞經(jīng)過不同的分化方法可以分化為膽堿能、腎上腺素能或多巴胺能表型，分化的特征是細胞增殖停止，以及形態(tài)、生化和功能改變。形態(tài)學上，細胞突起明顯延長;生化變化包括神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)節(jié)劑、酶活性、神經(jīng)組織特異性蛋白和囊泡蛋白的增加;從功能上講，細胞的膜電位增加，導致細胞興奮性增強。

多種化合物可誘導SH-SY5Y細胞分化，常用的分化劑有維甲酸、十四烷基佛波醇醋酸酯、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子。另外，神經(jīng)生長因子、星形孢子素、17β-雌二醇、膽固醇、二丁酰環(huán)磷腺苷、胰島素樣生長因子1、胰高血糖素樣肽-1等也可誘導SH-SY5Y細胞分化。

不同的分化劑組合，不同的培養(yǎng)環(huán)境也可促進細胞分化為更接近于體內(nèi)的成熟人類神經(jīng)元，分化后的SH-SY5Y細胞表現(xiàn)出不同的生化和功能改變。SH-SY5Y細胞經(jīng)過逐漸去除血清，添加維甲酸、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和細胞外基質(zhì)蛋白，以及連續(xù)裂解來篩選分化的成熟貼壁神經(jīng)元形成完全分化的SH-SY5Y神經(jīng)元，比未分化的細胞更接近于成熟人類神經(jīng)元。

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子是軸突標記物tau和樹突狀微管相關(guān)蛋白-2表達的關(guān)鍵驅(qū)動和調(diào)節(jié)因子，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子促進突觸發(fā)生和突觸連接的形成。在維甲酸處理下，SH-SY5Y細胞形成基本的軸突，但是在維甲酸-腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子聯(lián)合作用下，SH-SY5Y細胞分化并顯示出分子不對稱和大量神經(jīng)元標記物的表達，維甲酸-腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對SH-SY5Y細胞的序貫調(diào)節(jié)導致了形態(tài)和分子的快速極化，模擬了真實神經(jīng)元的分化。

另外，Goldie等通過對SH-SY5Y細胞的基因表達和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控環(huán)境的研究發(fā)現(xiàn)，全反式維甲酸和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的序貫調(diào)節(jié)分化誘導關(guān)鍵突觸基因，腦特異性miRNA和miRNA生物發(fā)生機制的表達以及乙酰膽堿酯酶活性增加，產(chǎn)生更多具有特征的成熟神經(jīng)元細胞群體。相比之下，僅由全反式維甲酸誘導的變化似乎在未成熟的神經(jīng)母細胞和成熟的神經(jīng)元之間產(chǎn)生了一種中間表型，并且可能是研究發(fā)育中神經(jīng)元的合適模擬物。而Strother等提出了一種新穎、簡單、無腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的技術(shù)，即使用維甲酸誘導細胞分化，將SH-SY5Y細胞在含5-氟脫氧尿苷、鐵強化小牛血清或市售血清替代品(SR-2)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，形成了SH-SY5Y細胞的有效分化和長期培養(yǎng)。

此外，在無血清培養(yǎng)條件下，維甲酸和GLP-1可誘導SH-SY5Y細胞分化為形態(tài)和生理成熟的谷氨酸和多巴胺能神經(jīng)元。用維甲酸預(yù)處理然后進行ECM凝膠培養(yǎng)，并結(jié)合腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白β1、NGF和維生素D3處理可產(chǎn)生與成人神經(jīng)元明顯相似的可持續(xù)細胞。SH-SY5Y細胞生長在層粘連蛋白包被的玻璃片上，用維甲酸處理后，顯示出良好的神經(jīng)元分化的形態(tài)，并強烈附著在玻片上(作為下游功能分析中穩(wěn)定的細胞間連接的一部分)，使其適合于研究突觸分子。

以人神經(jīng)干細胞條件培養(yǎng)液為誘導劑，與維甲酸聯(lián)合誘導SH-SY5Y細胞向神經(jīng)元分化，SH-SY5Y細胞在3 d內(nèi)就足以產(chǎn)生神經(jīng)元，顯著縮短了SH-SY5Y細胞產(chǎn)生神經(jīng)元分化所需的時間，而且能顯著提高SH-SY5Y細胞中神經(jīng)元的比例。利用與基質(zhì)細胞系PA6的共培養(yǎng)系統(tǒng)可以更容易，更快速地誘導SH-SY5Y細胞分化為與成熟原代神經(jīng)元非常接近的特性，這種分化加快了速度，縮短了時間，能夠獲得足夠分化的細胞以供實驗使用。

SH-SY5Y細胞在神經(jīng)退行性疾病中的應(yīng)用

人神經(jīng)母細胞瘤細胞系SH-SY5Y是研究神經(jīng)退行性疾病的常用細胞系。神經(jīng)分化的SH-SY5Y細胞表達神經(jīng)元特異性標志物，更適用于帕金森病、阿爾茨海默病等的生化、毒理學研究。

SH-SY5Y細胞對帕金森病的應(yīng)用

帕金森病的特征是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的死亡，魚藤酮、1-甲基-4苯基-1，2，3，6-四氫吡啶( MPTP)和6-羥基多巴胺等毒素可引發(fā)與運動和行為改變相關(guān)的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元死亡，被廣泛應(yīng)用于帕金森病實驗?zāi)Ｐ汀?

SH-SY5Y細胞的未分化和分化兩種形式都被廣泛應(yīng)用于帕金森病的研究，但是哪種細胞是最合適的模型仍在爭論中。通過比較未分化的SH-SY5Y細胞和分化的SH-SY5Y細胞的大量神經(jīng)元標志物，以及對帕金森病神經(jīng)毒素1-甲基-4苯基-吡啶離子和6-羥基多巴胺的反應(yīng)性，Cheung等發(fā)現(xiàn)未分化的SH-SY5Y細胞在維甲酸分化后多巴胺能特性沒有改變，但對帕金森神經(jīng)毒素的敏感性降低，因此認為未分化的SH-SY5Y細胞可能更適合作為實驗性帕金森病研究的模型。

而Lopes等將SH-SY5Y細胞維甲酸分化后，分化細胞在分化后第4天、第7天和第10天中神經(jīng)元標志物酪氨酸羥化酶、神經(jīng)元特異性烯醇化酶和神經(jīng)元核蛋白的免疫含量明顯高于未分化細胞，在分化的第7天和第10天，對神經(jīng)毒素6-羥基多巴胺的敏感性增加，因此認為第7天維甲酸分化的SH-SY5Y細胞是研究帕金森病病理生理基礎(chǔ)的分子和細胞機制的更合適的實驗?zāi)Ｐ汀?

1-甲基-4苯基-吡啶離子或魚藤酮誘導的毒性機制取決于不同的分化細胞類型，應(yīng)用維甲酸、佛波酯12-肉豆蔻13-醋酸酯和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導SH-SY5Y細胞分別分化為膽堿能乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)陽性表型及多巴胺能TH陽性表型。

氧化應(yīng)激在多巴胺能表型中占主導地位，而炎癥介質(zhì)在膽堿能表型中占主導地位，兩種分化細胞在暴露于線粒體毒素的情況下都表現(xiàn)出鈣蛋白酶的激活。有研究者認為，維甲酸處理SH-SY5Y細胞誘導促進一般神經(jīng)元樣表型和主要多巴胺能特征的分化程序。維甲酸分化的SH-SY5Y細胞能夠攝取1-甲基-4苯基-吡啶離子，很可能是通過多巴胺和去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運蛋白，其模仿體內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元攝取1-甲基-4苯基-吡啶離子，因此，檢測1-甲基-4苯基-吡啶離子在維甲酸分化的神經(jīng)元樣細胞中的作用，可能會更準確地模擬帕金森病腦中多巴胺能神經(jīng)元的線粒體功能障礙。

而另有研究者認為，維甲酸+TPA誘導分化的SH-SY5Y細胞表現(xiàn)出更明顯的多巴胺能表型，表現(xiàn)出與體內(nèi)多巴胺神經(jīng)元相似的1-甲基-4苯基-吡啶離子毒性特征。與維甲酸+TPA分化細胞相比，維甲酸分化細胞對多巴胺的攝取明顯減少，對1-甲基-4苯基-吡啶離子的毒性不敏感，且對1-甲基-4苯基-吡啶離子的毒性不受多巴胺轉(zhuǎn)運蛋白阻滯劑的抑制。維甲酸+TPA分化的SH-SY5Y細胞為探索1-甲基-4苯基-吡啶離子引起的細胞死亡機制提供了一種更可行的模型。分化的SH-SY5Y細胞暴露于低劑量魚藤酮模型模擬了早期帕金森病的變化，可能有助于篩選該疾病階段的神經(jīng)保護療法，特別是那些可能防止突起回縮和路易神經(jīng)突起形成的初始病理的療法。

α-突觸核蛋白是帕金森病的主要成分。α-突觸核蛋白可以與多巴胺轉(zhuǎn)運蛋白相互作用，減少底物攝取，調(diào)節(jié)多巴胺傳遞，從而影響神經(jīng)元功能。過表達的α-突觸核蛋白可以形成α-突觸核蛋白聚集體，誘導SH-SY5Y細胞的細胞毒性和凋亡。在亞鐵存在的情況下，維甲酸和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導神經(jīng)元分化促進胞漿內(nèi)α-突觸核蛋白陽性包涵體的形成，這些包涵體與人路易體有相同的基本免疫病理特征。Song等設(shè)計了表達人突變型A53T α-突觸核蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞，證明了作為研究帕金森病突觸核蛋白異常聚集的細胞模型，SH-SY5Y細胞中類似突觸核蛋白異常調(diào)節(jié)通路的完整性。Vasquez等建立并鑒定了一個含有Tet-on SNCA cDNA盒的SH-SY5Y細胞系，它不僅避免了高水平的α-突觸核蛋白對分化的不利影響，而且允許在神經(jīng)元分化之前/之后有控制的、有條件的和可重復的α-突觸核蛋白的過度表達，與其他常規(guī)使用的細胞模型相比，這種可誘導的神經(jīng)細胞系為帕金森病和其他帕金森病樣突觸病變提供了一個可靠和更相關(guān)的細胞模型。Pantazopoulou等研究了在誘導表達人α-突觸核蛋白神經(jīng)分化的SH-SY5Y神經(jīng)母細胞瘤細胞中，重組α-突觸核蛋白預(yù)制纖維(PFF)誘導α-突觸核蛋白組裝的周轉(zhuǎn)。這一成熟的細胞模型可以被證明是評估α-突觸核蛋白組件的聚集和周轉(zhuǎn)以及不同翻譯后修飾(即磷酸化、泛素化、截斷、磺?；?的作用及其對寡聚化的影響的重要工具，并可以進一步篩選影響α-突觸核蛋白聚集、清除、分泌和細胞間傳遞的修飾物。

SH-SY5Y細胞對阿爾茨海默病的應(yīng)用

阿爾茨海默病的特點是認知功能減退，并伴有膽堿能神經(jīng)元的特定變性。組織學上，阿爾茨海默病的主要病理特征有2個：神經(jīng)纖維纏結(jié)和淀粉樣蛋白-β的細胞外沉積。阿爾茨海默病體外模型的一個重要特征是基于表達阿爾茨海默病相關(guān)基因的人膽堿能神經(jīng)元的產(chǎn)生，形成tau磷酸化及淀粉樣蛋白-β沉積病理生理學相似的體外模型有助于研究阿爾茨海默病疾病機制及篩選神經(jīng)保護藥物等。

維甲酸分化后，SH-SY5Y細胞獲得了膽堿能樣表型，適合作為研究淀粉樣蛋白-β暴露對膽堿能影響的細胞模型。在維甲酸+腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子處理的細胞中，我們觀察到膽堿能標志物的高表達和酶活性。聯(lián)合使用亞致死劑量的岡田酸和可溶性淀粉樣蛋白-β寡聚體處理分化的SH-SY5Y細胞，提供了一種與最初受阿爾茨海默病影響的膽堿能神經(jīng)元的病理生理學相似的體外模型。二丁酰環(huán)磷腺苷對去甲腎上腺素能表型的處理和維甲酸+腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對膽堿能表型的處理增加了細胞對淀粉樣蛋白-β42毒性的易感性，二丁酰環(huán)磷腺苷分化和維甲酸+腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子分化的SH-SH5Y細胞可能為進一步研究淀粉樣蛋白-β的毒性機制以及篩選保護神經(jīng)細胞免受淀粉樣蛋白-β毒性作用的化合物提供依據(jù)。

維甲酸+TPA分化的多巴胺能SH-SY5Y細胞具有對淀粉樣蛋白-β介導的毒性具有高度抗性的特點，維甲酸+TPA分化細胞可用于揭示淀粉樣蛋白-β耐受的機制，有助于更好地理解阿爾茨海默病的神經(jīng)退行性變和神經(jīng)保護作用。閆宇輝等采用APP基因轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞模擬 淀粉樣蛋白-β沉積致阿爾茨海默病的細胞模型，進而探究藥物的神經(jīng)保護作用。

在維甲酸+腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子分化的SH-SY5Y細胞中，tau的含量和磷酸化狀態(tài)均增加，這與形態(tài)學上明顯的突起生長一致。維甲酸+腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子分化的SH-SY5Y細胞可作為研究tau磷酸化機制和篩選潛在的GSK3β抑制劑的合適模型。Agholme等將SH-SY5Y 細胞用維甲酸預(yù)處理，然后在培養(yǎng)基中加入腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白、神經(jīng)生長因子和VitD3的細胞外基質(zhì)凝膠培養(yǎng)分化為神經(jīng)元樣細胞，顯示出成熟神經(jīng)元的形態(tài)和生化特征，tau的表達水平與成人大腦相當，這種細胞體外模型可用于阿爾茨海默病的研究。

小結(jié)

SH-SY5Y細胞來源于人骨髓，是神經(jīng)母細胞瘤細胞系的亞克隆，通過不同的分化方法可以使SH-SY5Y細胞分化為更成熟的神經(jīng)元樣表型，表現(xiàn)出一系列極具指導性的神經(jīng)生物學特性，從而促進對神經(jīng)元細胞和分子機制的研究。

SH-SY5Y細胞廣泛應(yīng)用于神經(jīng)退行性疾病的實驗研究，不同的分化導致細胞代謝和特定神經(jīng)元特征的差異，因此，不同的分化方案可使SH-SY5Y細胞表達不同的神經(jīng)元表型，且能讓SH-SY5Y細胞應(yīng)用于不同疾病病理生理機制研究的優(yōu)點和局限性表現(xiàn)出來，選擇分化方案顯得至關(guān)重要。

另外，基因方法也應(yīng)用于SH-SY5Y細胞的功能研究中，以靶向與疾病相關(guān)的一種或多種途徑。這些對不同的分化SH-SY5Y細胞模型的正確利用將更有利于神經(jīng)退行性疾病的病理機制及疾病的藥物治療研究。

用于PARP-1依賴性程序性細胞死亡(Parthanatos)在布比卡因致SH-SY5Y細胞損傷中作用的研究

應(yīng)用SH-SY5Y細胞培養(yǎng)技術(shù),通過檢測細胞內(nèi)PARP-1的表達、PAR含量變化及細胞內(nèi)NAD+水平的變化,初步明確布比卡因所致的神經(jīng)毒性中是否存在Parthanatos;同時通過外源性NAD對布比卡因所致的細胞內(nèi)ROS含量增加、線粒體膜電位降低、細胞核損傷及細胞凋亡的影響,確定外源性NAD是否有助于減輕布比卡因的神經(jīng)毒性。

其目的在于從新的角度探討在布比卡因神經(jīng)毒性的機制,為臨床上防治局麻藥的神經(jīng)毒性提供實驗依據(jù)。第1章布比卡因神經(jīng)毒性是否與多聚腺嘌呤二核苷酸核糖聚合酶-1(Poly(ADP-ribose)polymerase-1,PARP-1)激活有關(guān)目的明確布比卡因是否導致SH-SY5Y細胞PARP-1激活,其神經(jīng)毒性是否與激活PARP-1有關(guān)。

方法以1-10mM布比卡因培養(yǎng)液處理SH-SY5Y細胞30分鐘-6小時,以Western-blot法檢測細胞內(nèi)PARP-1及其代謝產(chǎn)物-多聚腺苷二磷酸核糖(Poly-(ADP)ribose,PAR)的表達情況;以100nM、200nM的PARP-1抑制劑-PJ34培養(yǎng)液與5mM布比卡因培養(yǎng)液共同處理細胞30分鐘,或單獨以5mM布比卡因處理細胞30分鐘,光鏡下觀察其對布比卡因所致細胞形態(tài)改變的影響,并以CCK-8法其對細胞存活率的影響。

計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示,采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。不同濃度布比卡因處理30分鐘后細胞內(nèi)PARP-1及PAR的表達、1mM布比卡因處理0-6小時后細胞內(nèi)PAPR-1及PAR的表達采用完全隨機單因素方差分析,組間比較采用LSD法(方差齊)或Dunnett’s T3法(方差不齊);PJ34對布比卡因處理后細胞存活率的影響采用兩因素析因設(shè)計資料方差分析,組間比較采用LSD法(方差齊)或Dunnett’s T3法(方差不齊)。

參考文獻

[1]Glutathione synthesis and its role in redox signaling[J].Hongqiao Zhang,Henry Jay Forman.Seminars in Cell and Developmental Biology.2012(7)

[2]Bupivacaine induces apoptosis via mitochondria and p38 MAPK dependent pathways[J].Jun Lu,Shi yuan Xu,Qing guo Zhang,Rui Xu,Hong yi Lei.European Journal of Pharmacology.2011(1)

[3]Ropivacaine Versus Bupivacaine for Epidural Labor Analgesia[J].Yaakov Beilin,Stephen Halpern.Anesthesia&Analgesia.2010(2)

[4]PARP inhibitors:New tools to protect from inflammation[J].Vincenzo Giansanti,Francesca Donà,Micol Tillhon,A.Ivana Scovassi.Biochemical Pharmacology.2010(12)

[5]鄭艇.PARP-1依賴性程序性細胞死亡(Parthanatos)在布比卡因致SH-SY5Y細胞損傷中作用的研究[D].南方醫(yī)科大學,2014.

Ross RA, et al. Coordinate morphological and biochemical interconversion of human neuroblastoma cells. J. Natl. Cancer Inst. 71: 741-749, 1983. PubMed: 6137586

Biedler JL, et al. Multiple neurotransmitter synthesis by human neuroblastoma cell lines and clones. Cancer Res. 38: 3751-3757, 1978. PubMed: 29704

Ross RA, et al. Coordinate morphological and biochemical interconversion of human neuroblastoma cells. J. Natl. Cancer Inst. 71: 741-749, 1983. PubMed: 6137586