MKN-7人胃癌細胞來源

MKN-7細胞是在1989由Hojo, H從一位39歲男性患者的高分化的胃管狀腺癌中建立的。MKN-7細胞高表達c-erb B2的產(chǎn)物。

MKN-7人胃癌細胞形態(tài)特征

MKN-7人胃癌細胞產(chǎn)品信息

細胞名稱：MKN-7，人胃癌細胞

細胞別稱：MKN-7; MKN 7;MKN7; 人胃癌細胞

種屬來源：人

年齡性別：女，39歲

組織來源：胃

生長特性：貼壁生長

細胞形態(tài)：上皮細胞樣

STR位點信息：Amelogenin：X;CSF1PO：10,13;D3S1358：17;D5S818：9,13;D7S820：9,11;D8S1179：15;D13S317：8,12;D16S539：9,10;D18S51：13,18;D21S11：29,32.2;FGA：23;Penta D：10,11;Penta E：18;TH01：7,9;TPOX：9;vWA：17;

保藏機構(gòu)：CLS; 305104;JCRB; JCRB1025;RCB; RCB0999;RCB; RCB3687;TKG; TKG 0228;

培養(yǎng)基：RPMI-1640+10% FBS+1% P/S

培養(yǎng)條件：氣相：100%空氣;溫度：37℃

凍存條件：無血清凍存液，液氮儲存

MKN-7人胃癌細胞培養(yǎng)操作說明

細胞培養(yǎng)的基本條件

實驗室條件

1. 無菌環(huán)境：無菌室包括更衣室，緩沖間，風(fēng)淋間，操作間

2. 儀器設(shè)備：超凈工作臺-操作平臺、CO2 培養(yǎng)箱-細胞生長的環(huán)境、倒置顯微鏡-觀察細胞、離心機-離心收集細胞、冰箱-放置培養(yǎng)基等試劑、水浴鍋-復(fù)蘇細胞、真空泵-收集廢液、滅菌鍋-滅菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-凍存細胞、純水儀-制備一級水

3. 器材耗材：玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、巴士管、離心管、移液槍、槍頭(白色 0-10ul;黃色 20-200ul;藍色 100-1000ul)、濾器，吸管，多孔培養(yǎng)皿、6cm 皿、10cm 皿，培養(yǎng)瓶等。

4. 試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基、FBS胎牛血清、雙抗、胰酶(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)、pbs

操作者工作范疇

1. 無菌操作：洗手，戴手套，穿實驗服，常噴 75%酒精

MKN-7人胃癌細胞復(fù)蘇步驟

1.準(zhǔn)備：紫外線照臺 30min，提前打開水浴鍋設(shè)置 37℃，培養(yǎng)基臨用前放水浴箱里溫育20 分鐘(或者放在超凈工作臺常溫放 30min)。在操作臺上擺放好物品，左邊放完全培養(yǎng)液，1mL 槍頭(已滅菌)，培養(yǎng)皿，右上角放廢液缸，1mL 移液槍，3mL 巴氏管。檢查離心機，廢液泵。

2)待水浴鍋溫度達到 37℃時，戴上手套和護目鏡，從-196℃液氮罐中取出凍存管，將含有1 mLMKN-7細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，同時不斷輕輕搖動凍存管，盡量保證凍存管內(nèi)細胞 1min 內(nèi)融化，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻， 移入離心機中 100rpm 離心 3min，以 75%酒精噴凍存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。

3)用 3mL 巴氏管取 5mL 新鮮培養(yǎng)基到一個新的 6cm 培養(yǎng)皿中，(若離心后細胞量較多，可取 12mL 新鮮培養(yǎng)基到一個新的 10cm 培養(yǎng)皿中)，標(biāo)記日期、所用培養(yǎng)基名稱和細胞名稱。

4)用廢液泵(吸力不要太大)取一個黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取 1mL 新鮮培養(yǎng)基重懸細胞后(充分混勻)，將細胞懸液加入到培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺上以畫“8”字法鋪勻MKN-7細胞(一般培養(yǎng)皿在臺子上畫 30 個 8 字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測是否鋪勻細胞。

5)確定MKN-7細胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入 CO2 培養(yǎng)箱過夜。(盡量平直放入不要晃動)，第二天換液并檢查細胞密度。

MKN-7人胃癌細胞傳代操作

1)從培養(yǎng)箱拿出細胞，在顯微鏡下觀察細胞密度和細胞狀態(tài)，當(dāng)細胞狀態(tài)良好，且密度達到 85%左右的時候即可進行傳代;

2)打開廢液泵，用廢液泵吸頭(吸力不要太大)取一個藍色槍頭吸走上清廢液，用巴士管取 4ml 不含鈣、鎂離子的1xPBS(6cm 皿)到細胞培養(yǎng)皿中(若是 10cm 皿則取 8ml 1xPBS)，輕輕晃動以清洗細胞表面1-2次;

3)用廢液泵吸走 PBS 廢液，加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)于培養(yǎng)瓶中，拿起培養(yǎng)皿輕輕轉(zhuǎn)動以便胰酶浸泡到每個MKN-7細胞，消化 1-3min(根據(jù)MKN-7細胞貼壁情況判斷，貼壁較牢的消化時間長一點或者放入 CO2 培養(yǎng)箱中消化幾分鐘)后，在顯微鏡下觀察細胞是否變圓變亮，一旦發(fā)現(xiàn)大量細胞胞質(zhì)回縮，細胞間隙增大，即將脫離培養(yǎng)皿底，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

4)用 1ml 移液槍輕柔吹打，保證培養(yǎng)皿底的每個角落都吹打到，邊緣處也不能忽略(吹打時盡量避免產(chǎn)生氣泡，因其對細胞有傷害;需輕柔吹打，用力吹打?qū)毎灿袀?，把培養(yǎng)瓶中所有MKN-7細胞懸液用吸 1ml 移液槍移入無菌離心管中。

5)將裝有細胞懸液的離心管放入離心機中(配平)，1000 轉(zhuǎn)離心 3-5min，用廢液泵取一個黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取 1-2mL 新鮮培養(yǎng)基重懸細胞后(充分混勻)，將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺上以畫“8”字法鋪勻細胞(一般培養(yǎng)皿在臺子上畫 30 個 8 字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測是否鋪勻細胞。

6) 確定MKN-7細胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入 CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(盡量平直放入不要晃動)。第二天再觀察細胞密度。

MKN-7人胃癌細胞凍存準(zhǔn)備

從培養(yǎng)箱拿出細胞，在顯微鏡下觀察細胞密度和細胞狀態(tài)，待細胞生長狀態(tài)良好且存活率高的狀態(tài)下，細胞密度達 80–90%時，可進行細胞凍存操作，以T25 瓶為例

MKN-7細胞凍存步驟

a.收集細胞及細胞培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶內(nèi)所有培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無菌離心管，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數(shù)。

b.根據(jù)MKN-7細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液， 在細胞凍存管上貼上細胞標(biāo)簽(細胞標(biāo)簽上包含：細胞名稱、凍存日期、培養(yǎng)用的 培養(yǎng)基)。

c.將凍存管入庫到-80 度凍存盒里，放置 24 小時后，即可移入液氮中保存，標(biāo)記好入庫位置和凍存日期。

MKN-7細胞培養(yǎng)注意事項

a.生長速度很慢

MKN-7人胃癌細胞倍增時間約3天左右，正常培養(yǎng)5~7天可傳代一次;

b.貼壁形態(tài)展開較大

MKN-7人胃癌細胞消化之后一瓶細胞量比較少，傳代時的比例建議1：2，凍存時1瓶細胞只能凍一管;

c.折光度較低

MKN-7人胃癌細胞在顯微鏡下觀察時，輪廓有時不清晰，觀察時顯微鏡亮度請勿太高，否則可能看不到細胞邊界;

d.較難消化

常規(guī)的消化方法難以把控，加入培養(yǎng)基后細胞會迅速貼壁。建議使用浸泡消化，使用胰酶完全浸潤MKN-7人胃癌細胞，直接放入37℃ 的環(huán)境中進行消化，消化時間一般在7~10分鐘。

待部分細胞脫壁漂起后，鏡下觀察，大部分細胞有脫壁跡象后加入適量胰酶，輕輕吹打，將細胞吹落、吹散，隨后吸出器皿，加入培養(yǎng)基終止消化，離心收集。

若還有少量細胞無法輕輕吹下，則在吸出脫落細胞后，加入胰酶繼續(xù)消化再收集。

小貼士：使用這種消化方法，可能會造成一定的細胞損失。

MKN-7人胃癌細胞培養(yǎng)常見問題

1.MKN-7人胃癌細胞傳代密度

MKN-7細胞呈上皮樣生長，是密度依賴型細胞，接種細胞數(shù)量直接影響細胞生長速度。建議融合度90%以上再進行傳代。

2.MKN-7人胃癌細胞消化時間多久

MKN-7細胞不易消化，消化時間建議培養(yǎng)箱5分鐘以上，顯微鏡下觀察細胞全部脫落，再終止消化。終止后，建議使用完培收集2-3次，盡量減少操作損失。

3.MKN-7細胞凍存密度多大

凍存MKN-7人胃癌細胞時，建議密度要略大于普通細胞(兩盤10cm皿凍3管)，以保證復(fù)蘇后細胞量。

MKN-7人胃癌細胞應(yīng)用

MKN7人胃癌貼壁細胞系可以用于PNO1通過自噬效應(yīng)促進胃癌增殖的機制研究

自噬作為一種程序性死亡機制在腫瘤中的作用越來越受到研究者們的關(guān)注,靶向自噬已經(jīng)成為腫瘤治療的一種重要手段。之前的研究表明核糖體裝配因子PNO1可以調(diào)節(jié)腫瘤的增殖、侵襲、自噬和凋亡等表型,但目前在胃癌中的作用還沒有被報道。本研究旨在揭示PNO1在胃癌中的作用及調(diào)節(jié)機制,為胃癌治療提供新的靶標(biāo)。

方法：利用生物數(shù)據(jù)庫中的信息檢測PNO1在胃癌和癌旁組織中的表達,并收集青島大學(xué)附屬醫(yī)院經(jīng)病理確診的胃癌和癌旁手術(shù)標(biāo)本進行免疫組化分析驗證,使用小干擾RNA、慢病毒顆粒構(gòu)建PNO1敲低和過表達的胃癌細胞株,使用蛋白免疫印跡和實時定量PCR來驗證PNO1在胃癌細胞的表達及轉(zhuǎn)染效率,通過平板克隆形成實驗和Ed U細胞增殖實驗檢測PNO1對胃癌細胞增殖的影響,使用蛋白免疫印跡和免疫熒光實驗檢測PNO1對自噬的調(diào)節(jié),通過蛋白免疫印跡分析PNO1對PI3K/AKT/mtor信號通路的調(diào)控作用,最后通過小鼠胃原位荷瘤模型驗證PNO1在體內(nèi)對胃癌增殖的作用。

結(jié)果：在本研究中,發(fā)現(xiàn)PNO1在胃癌組織和細胞中高表達并且相對高表達的PNO1水平與胃癌患者的不良預(yù)后相關(guān),過表達PNO1提高了胃癌細胞的增殖水平,敲低PNO1抑制了體內(nèi)外胃癌的增殖能力,并提高了胃癌細胞的自噬水平,抑制自噬逆轉(zhuǎn)了PNO1敲低導(dǎo)致胃癌細胞增殖能力下降的趨勢,此外,敲低PNO1還抑制了PI3K/AKT/mtor信號通路的激活。

結(jié)論：研究表明PNO1高表達是胃癌患者的不良預(yù)后因素,PNO1通過抑制自噬效應(yīng)促進了胃癌的增殖能力,這為探索胃癌發(fā)病機制提供了新的思路,靶向PNO1/自噬軸成為胃癌治療的潛在方案。

參考文獻

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