細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)孔的孔數(shù)有6、12、24、48、96、384、1536 孔等，孔的底部可以選擇平的、圓的，或錐形的，這取決于細胞類型和下游應用。對于傳統(tǒng)的2D細胞培養(yǎng)(如HeLa或MDCK細胞)，特別是需要對培養(yǎng)物進行成像或分光光度測定，通常首選平底(F-bottom)。對于不存在接觸抑制的細胞，弧形底(C-bottom)也不錯。圓底(U-bottom)適合懸浮培養(yǎng)(如球體細胞培養(yǎng))，因為圓的表面讓細胞難以附著和生長。而錐形底很少用于細胞培養(yǎng)實驗，但在細胞沉淀時可能有用。以下主要為大家介紹6、24、96孔板如何接種和換液?

6孔板接種和換液問題

問題1：我的細胞傳代很正常，但一種到六孔板里(不管加藥和對照)，總有兩三個孔(隨機)細胞長得不好，很小，像破碎了。有人遇到過這種情況嗎?到底是啥原因呢?

答：可能跟你加液的溫度有關(guān)。如果你細胞剛剛拿出來換液加液，培養(yǎng)基也是從4度冰箱拿出來不久，很容易細胞就會凍死了。建議你最好把培養(yǎng)基先在培養(yǎng)箱里邊孵育15min先。

另外，跟你細胞的生長狀態(tài)也有關(guān)。加藥之前的細胞可以用高點的血清濃度培養(yǎng)。保證細胞狀態(tài)良好。

或者放在37度水浴鍋里孵育也可以，或者是培養(yǎng)板本身的問題，你再換換其他培養(yǎng)板試試看。再有可能就是細胞狀態(tài)問題了，種板時的血清濃度調(diào)高試一下。

問題2：最近幾天，我用六孔培養(yǎng)板接種細胞，培養(yǎng)24小時后更換培養(yǎng)基，在更換培養(yǎng)基之前，顯微鏡觀察到細胞貼壁，狀態(tài)非常的好，更換了培養(yǎng)基后，立即用顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)每個孔中都近乎有一半的細胞表現(xiàn)出近乎死亡的狀態(tài)。細胞變得非常小，產(chǎn)生大量的碎片，而另一半的細胞一切正常，異常細胞與正常細胞之間存在一條分水嶺，上半個圓是好的，下半個圓就不好，這是怎么一回事?

答：你可以看一下是不是培養(yǎng)板沒放水平。有一回我也出現(xiàn)過這種情況。

你的培養(yǎng)液如何，如果培養(yǎng)液過期，細胞就不會貼壁。換一點新配制的培養(yǎng)液試一試。

我也經(jīng)常碰到，我想可能是板的問題，換一個牌子的板或換用培養(yǎng)瓶就沒問題了。

不知樓主所需換液的培養(yǎng)板多不多，換培養(yǎng)基的時候如果沒有注意風機的影響，特別是所需換液的培養(yǎng)板很多時，容易使細胞因風吹失水而干縮破裂。如果如此，換液時應該逐個培養(yǎng)板進行，別怕浪費吸管，注意操作的效率!

24孔板接種問題

問題1：我把細胞消化接種到24孔板之后，已經(jīng)四天了，老是每孔的中間部分長不滿，每天換液時都用PBS 清洗，第二天換液時都出現(xiàn)同樣的情況，每孔的邊緣長的很好，中央大量死細胞，我也不知道是什么原因?

答：是中央長不滿，還是中央有和邊緣相同密度的細胞，但是大部分都是死細胞?如果是前者，也許不是技術(shù)問題，而是物理問題了。

我是選擇孔內(nèi)鋪蓋玻片，在玻片上種植。每次換液都用PBS洗，必要的步驟嗎?另外，也有可能和細胞種類有關(guān)或者和培養(yǎng)液有關(guān)?

我想你的培養(yǎng)液可能加的太少了。由于表面張力的作用，培養(yǎng)板的邊緣液體會向上走，造成培養(yǎng)液面呈現(xiàn)一個凹面(就像量筒的液體凹面一樣)，中央的細胞正好在凹面的最低處，培養(yǎng)液少，細胞的營養(yǎng)不夠，甚至干涸掉，空氣中的氧氣也會造成損傷，即使有增值過來的細胞也會死掉。

另外，檢查一下培養(yǎng)箱底部的水是否少了，如果少了，箱內(nèi)的空氣濕度不夠，會造成培養(yǎng)液揮發(fā)加快，這樣即使剛加的液體不少，過一段時間，由于蒸發(fā)，液體量會減少，造成中央干涸。并且這樣會改變了培養(yǎng)液的成分濃度，造成滲透壓過高。

個人經(jīng)驗認為這是物理問題：24孔板小，細胞接種進去后是很難搖均勻的，結(jié)果導致細胞重貼壁后呈現(xiàn)四周密中間稀的狀況。

至于中間較多死細胞，如果是懸浮狀的話，也一樣是物理問題。接種后比較粗暴的碰撞，似乎對搖均勻細胞有一定效果。

在為多孔板培養(yǎng)的細胞換液時一定要注意，不要把培養(yǎng)基吸得太干，如果完全吸取，很容易造成細胞干涸，這樣的話細胞會很快死亡。我有一段時間總是遇到這個問題，一個板子中總有一兩個孔出現(xiàn)細胞大量死亡，后來發(fā)現(xiàn)是上面的原因?，F(xiàn)在我做的時候如果必須把液體吸干，我會一個一個空來吸取，最多一次不超過3孔，然后馬上加入液體，同時在作轉(zhuǎn)染時，我會在吸液和加液時將風機關(guān)掉，這樣基本上會避免細胞死亡。

同時你所說的細胞周圍密而中間稀疏，大約有如下原因

1.培養(yǎng)液加得太少。主要是由于液體張力的問題。

2.細胞接種后震蕩太厲害了。由于離心力作用導致細胞分布到周圍。

問題2：我的細胞在接種在24孔板上時，孔的周圍細胞密集，中間細胞稀少，我試了很多次均如此。請問怎樣操作才能使細胞分布均勻?

答：這種情況一般是種板時培養(yǎng)液過少，液面總是呈一凹面，如果液面過低，孔中間就基本上沒什么細胞，所以種板時一定不能吝嗇培養(yǎng)液，待貼壁后可以用比較少量的培養(yǎng)液處理

周圍細胞稀少，中間細胞密集:這種情況一般是種板后過于晃動，特別是旋轉(zhuǎn)著晃動.有人才用十字方向的晃動方法使細胞分散均勻.但我個人認為，將細胞加入孔后，用槍或移液器充分吹打混勻后就不用，也不能再晃動，甚至拿著孔板走路帶來的震動都會讓細胞往中間集中。

當然，無論是哪種情況，首先都需要保證細胞在種板時時均勻分布的，即種板時的細胞懸液一定要混勻。

細胞分布均勻與否有一點很關(guān)鍵，即每種細胞是有個體差異的，別人的細胞操作不一定適合于你，所以要靠自己摸索，且找出專屬于自己細胞的一套規(guī)律，就我個人而言，有如下經(jīng)驗：

1.所有待接種的細胞懸液在種板前一定要用吸管混勻。

2.按資料記載，24孔板的液體量為1ml，個人也覺得1ml的量足矣。

3.接種時，要慢慢加樣，且記得輕微旋轉(zhuǎn)槍頭，這樣做對細胞均勻分布有一定效果。

4.接種后最好直接放入培養(yǎng)箱讓細胞適應培養(yǎng)板這個新的環(huán)境，個人認為沒有必要在室溫放置一段時間。

5.根據(jù)細胞的特性，細胞均喜歡聚集在邊緣生長，所以我考慮到，你的問題還有可能是接種時的細胞密度不夠，導致周邊密集，中間稀疏的錯覺。你的拌種密度是多少?

另"要慢慢加樣，且記得輕微旋轉(zhuǎn)槍頭"的意思就是：加樣不能太快，避免細胞在一個加樣處聚集，且注意在不同的部位進行加樣，即邊加邊活動槍頭，人為使細胞趨于均勻分布，我個人覺得有一定的效果，不知這次我解釋清楚沒有。

96孔板細胞接種換液和收集細胞

問題1：最近我用96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)腫瘤細胞，結(jié)果細胞長得不是很理想，不是長得不均勻，就是每個孔細胞生長速度不一樣。另外，鏡下觀察細胞輪廓很不清晰，怎么調(diào)焦距效果都不好。(板子是剛拆封的。)不知道怎么回事?

答：You should make sure that you triturate the cells very well. If the cells tend to form clumps， use a pasteur pipet and pass the cells several times. Then count the cell using Trypan Blue. Plate 1-5*10^4 per well， depending on your desired density. Usually， only the 60 wells in the middle should be used for plating cells. Wells on the edge will have a decreased volume of media， so you should not add any cells in there， but you still need to put media or H2O inside those 36 wells.

首先你要盡可能把消化細胞消化成單個細胞(不要成團)，反復吹打，掌握好時間(不同的細胞要摸索的)，種細胞時要均勻的吸取，清清的吹打一遍再吸取細胞，這樣也許會解決您的問題。

種到96孔板的細胞一定要消化成單個細胞，建議用EDTA和胰酶消化。加血清后反復吹打。細胞量盡量少一點。

我一般在鋪板時都是用八排槍加樣的，感覺效果還不錯。首先如樓上所說要把細胞消化的恰到好處，背著光看瓶底細胞都下來后再對著瓶壁吹打幾次即可。然后將細胞懸液轉(zhuǎn)移到加樣槽中，在加樣過程中，要不停的輕輕晃動加樣槽，且在每次吸樣前都吹打幾次，以防細胞不是均勻的分散在培養(yǎng)基中，造成加樣不均。加樣時使槍頭貼著孔壁緩慢加入，使液體自然流滿即可。都加完后平穩(wěn)拿到鏡下觀察鋪的很漂亮的。聽別人說鋪完后在96孔板的四個角輕輕磕幾下，但我試過，這樣效果反倒不好!

我覺得你的問題可能是消化的不好，我的經(jīng)驗希望能有幫助

1、對細胞的選擇要注意，要選擇狀態(tài)好的細胞，密度要選分布瓶底80%為宜;

2、消化時，不要忘了用PBS(或純的不含血清的培養(yǎng)基)洗一遍，加0.25%的胰酶1ml消化2-3分鐘(不同的細胞有差別，你要摸索)，還要不時的活動，讓胰酶分布到每個角落，之后傾去胰酶，加3ml培養(yǎng)基(我認為加血清過于粘稠，不宜吹打，加培養(yǎng)基后稀釋胰酶可不考慮對細胞的損傷)，吹打成單個細胞;

3、接種時要注意細胞密度，多數(shù)細胞要求0.5-2的10的4次冪，這也要摸索一下(簡單：就是你種一個密度，如果在你測指標時細胞沒過多影響結(jié)果就行);

4、周邊的孔不要做指標檢測孔，你有沒有發(fā)現(xiàn)周邊的孔的細胞2天后狀態(tài)就明顯不好了;

5、接種細胞調(diào)整好濃度后，要一邊吹細胞懸液一邊接種;

6、還有你說看不清細胞，你注意到?jīng)]有，當把培養(yǎng)板那出孵箱一會，培養(yǎng)板蓋就有一層霧，會影響觀察細胞，你是不是這個問題?

問題2：我在96孔培養(yǎng)板上接種的細胞很均勻，但換液時，我用槍加150ul的培養(yǎng)基加入每個孔內(nèi)，結(jié)果在顯微鏡下觀察周邊細胞全被沖到孔中央去了，而中間的細胞層疊成致密的團塊，請問這樣的細胞對實驗有影響嗎?有其他的好辦法嗎? 是3T3-L1前脂肪細胞，要進行誘導分化成成熟脂肪細胞。所以我每次換液總把握不好。請問有誰有這方面的經(jīng)驗嗎?

答：我們實驗室一般用機械吸引器吸引，吸引器管前面套一個20ul加樣器的Tip頭，效果不錯，操作在無菌臺內(nèi)進行。Tip頭剪去尖端后滅菌使用，加液時液體呈滴狀滴入，就不會擾動孔底的細胞了。

3T3-L1前脂肪細胞不是貼壁的嗎?怎么會這么容易被沖到中間去?

我只聽說過第一次把細胞加到孔中的時候很容易讓細胞長得不均勻，3T3-L1前脂肪細胞要是貼壁了不容易被沖走了吧，要不然就不要用胰酶消化了。

建議：加液的時候沿著邊輕輕的加入，動作柔和，可以避免沖動細胞;去液的時候直接甩板，方便快捷。

去液的時候不建議直接甩板，容易污染?？梢约舻魌ip尖，不能直接沖細胞，沿孔壁輕輕加入，液體提前在孵箱里預熱10分鐘，有時候液體涼也會使細胞掉下來。

是換完液馬上就卷了，還是過一會兒才卷的?我覺得這個細胞狀態(tài)不好的時候是容易卷的，我誘導后換維持培養(yǎng)液時細胞卷的很厲害，原來也以為是換液造成的，后來觀察了一下不是。你在仔細分析一下，一定是換液造成的馬?一般帖壁細胞換液時即使是沖也只是一小部分破掉，不會大面積掉下來的，我認為。

換完液馬上就卷了，細胞好象是一大片全掉下來拉，并在浮動，然后我第二天在看時就發(fā)現(xiàn)細胞全堆在中間，我也沒在意，繼續(xù)換液.但現(xiàn)在是我把細胞從培養(yǎng)箱里拿出來肉眼就能看到每個孔中間有一個小白點.我以為是污染了，拿到顯微鏡下看又不太像，自己感覺是細胞疊在一起長的太密了，因為能看到很致密的細胞團.而周圍的細胞輪廓很清晰，但不是很多，為這個實驗我已經(jīng)鋪了5塊96孔板了，真不想再這樣繼續(xù)盲目下去。

我在96孔板中誘導細胞換液一般采用半量換液，這樣細胞就不會被沖走了，至于換液的間隔與細胞有關(guān)，我誘導肝細胞是隔天半量換液。如果卷得特別厲害，很可能是細胞的問題，建議更新細胞株。

問題3：我的細胞對胰酶和EDTA不管用.高濃度胰酶可以，但細胞存活率不高，有沒有小的細胞刮匙，(或者自制刮匙的方法)，可以用于96孔板?(我在建細胞系，非得用96孔板)。

答：一般情況下細胞在一次性培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中貼壁較緊，都不太好消化，如果建系的話最好不用刮的方法，還是消化比較好!消化時以下幾點注意了嗎?

消化前用D-Hanks沖洗了嗎?可以沖洗2-3遍。

適當增加胰酶濃度，提高胰酶PH值到8，減少消化時間應該對細胞影響不大。消化時放入37度培養(yǎng)箱。

如果細胞還是消化不下來可加適量膠原酶，有的細胞對膠原酶敏感。

市場上有買細胞刮刀，但是我用過的型號不適用與96孔。我在做96孔單克隆時一般采用酶消化法。 同意上樓的說法，消化前將細胞用D-Hanks沖洗，有助與消化，另外胰酶的最佳消化條件是 pH 8.0，37度最好. 如果效果還是不太好的話，可以采用多次消化方法。

問題4：D-Hanks和PBS沖洗效果有何不同?我在胰酶消化前一直用PBS沖洗。

答：首先，D-Hanks和PBS沖洗細胞都可以的，我兩種都用過，不過嚴格來說我認為D-Hanks更好，因為我們的胰酶是用D-Hanks溶的，所以用D-Hanks不改變胰酶的消化環(huán)境。

第二個問題，完全可以不用wash，加入帶血清的培養(yǎng)基之后胰酶將完全沒有作用，我一般都是這樣做的，但是如果EDTA濃度太高的話就需要wash了。