如何解決細胞培養(yǎng)板污染，首先細胞培養(yǎng)板在進行細胞操作時需遵循嚴格無菌的原則，各項操作要保證規(guī)范、科學，不對細胞的生長造成額外的影響。那么如何保證加樣后細胞的均勻和盡量減少換液對細胞生長狀態(tài)的影響。

細胞培養(yǎng)板污染問題及解決辦法

問題1：96，24孔培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿的蓋子都很松，這樣是方便了透氣，但是細菌、霉菌等污染物會不會也隨著溜進去呢?

答：1.蓋子很松，屬于半開放培養(yǎng)，這樣的目的是透氣(實際上是為了使培養(yǎng)皿外的co2能夠與培養(yǎng)皿充分交換，維持培養(yǎng)基的pH值)。

2.凡事有利必有弊，這樣當然增加了污染的可能性。此外這樣還會使培養(yǎng)皿內的液體蒸發(fā)，這對于精確定量的藥物來說就顯得值得注意了。所以以下二條措施是必須的a培養(yǎng)箱內空氣必須清潔(定期紫外線照，酒精擦洗，盡量少開關培養(yǎng)箱)b培養(yǎng)箱內的濕度必須始終保持為100%(培養(yǎng)箱內放置無菌蒸餾水的水槽)。

就好像培養(yǎng)皿，也是一個蓋倒扣的容器，也不會污染。主要是因為蓋子“L”型邊緣產生氣流負壓的緣故，灰塵上面才附著有微生物，而氣流攜帶的灰塵是無法通過產生負壓的蓋邊緣的。而透氣作用只是通過空氣的擴散，不會產生氣流，所以只會透氣不會透菌。

問題2：使用24孔板，在其中的某些孔中有操作(在超凈臺內)，而其他孔中還有細胞要培養(yǎng)，我很擔心這樣會污染，不知道要注意什么?

答：在超凈臺內如果操作規(guī)范的話應該可以的，可以充分利用培養(yǎng)版的蓋子，盡量只暴露要操作的孔，將其他孔用蓋子蓋起來。

使用前綜合考慮一下，充分使用所以的孔;如果只需要使用少數(shù)的孔可以只用一邊的，其余用蓋子蓋住。

其實自己感覺只要注意無菌操作，一般是不會污染的。操作時用幾塊玻片把板子一側墊高，不要把蓋子全打開，一般沒問題。

細胞分布不均及解決辦法

問題1：細胞接種培養(yǎng)板，細胞總是聚集在周邊部分，該如何處理

答：請問你的細胞是如何混勻的?是滴管吹打還是振蕩培養(yǎng)板?如果是后者，而且是轉圈搖勻的話，很有可能由于離心力的作用使細胞甩到周邊部分，導致細胞中間少，四周多!

這里提供一個好辦法：在培養(yǎng)種板之前，把培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱里進行幾個小時的飽和后再取出，種入細胞時力量要輕，可采取用滴頭在培養(yǎng)板孔的側面慢慢加入讓細胞懸液流入板孔中，培養(yǎng)的細胞基本是均勻生長。記住千萬不要用振蕩器振蕩，否則你的細胞就會想你說得那樣聚積在一起。

培養(yǎng)板孔直徑愈小，這個現(xiàn)象越明顯，24、96孔板這種現(xiàn)象不可避免，因為液體的附壁使得孔內培養(yǎng)液不是成一個液平面，而是周邊高，就像凹鏡一樣，而使用這兩種孔板由于需要加干預等原因而不能加足量培養(yǎng)液，使得細胞隨培養(yǎng)液一起出現(xiàn)“邊集”現(xiàn)象，如果為了使孔中央也有均勻細胞而增加接種細胞數(shù)量的話，這要看你需要觀察何種指標，如果是MTT，免疫組化的話會因為細胞成層而影響結果。

消化細胞時要注意吹打均勻，避免細胞成團，而且孔內培養(yǎng)液量要足夠，一般接種時加足量培養(yǎng)液，加干預時換一次液，干預液加培養(yǎng)液量等于接種時培養(yǎng)液量，這樣的話“邊集”現(xiàn)象會有所改觀，不妨一試。

問題2：我做的是空斑形成實驗，最好是細胞鋪成均勻的一層，，可接種病毒時大部分孔都還好，個別的不太均勻。細胞組內差異很大，想請教一下大家加細胞的時候都有什么方法?

答：細胞消化后吹打成單細胞懸液很關鍵!保證分板時每個孔的細胞數(shù)目是一致的!

當然還有處理因素各個孔之間的平行也很重要，比如說加藥時，藥物稀釋后混勻，保證每個孔的濃度是一致的!

再者加細胞和藥物時，要試驗組和對照組一塊輪流加，避免加樣先后順序導致細胞密度和藥物濃度的差異!

問：吹打已經是均勻了，但是鋪板，6孔，24孔總有些不均勻，有點往中間集中。而且明明計數(shù)好了鋪，長一兩天，各個孔密度又不一樣，對檢測有影響，有良策嗎?

答：如果用巴氏吸管鋪的話，每次吸取的量不要太多，因為吸管內的細胞會自動向下沉，往往第一開始幾個孔細胞數(shù)多，經常均勻細胞懸液，加液走S型路線。

如果用移液器的話，tips要處理下，把去掉避免損傷細胞，這樣每一次取液對應一個孔。用tip一對一孔加入比較準確。但也要注意混勻懸液。

設立平行組，n要足夠大(可以計算一下)。

鋪板后不要搖，因為搖動會導致細胞向中間聚集。最好鋪板一次搞定。

問題3：想請教一下大家加細胞的時候都有什么方法?

我覺得有幾點：

1.細胞消化后吹打成單細胞懸液很關鍵!保證分板時每個孔的細胞數(shù)目是一致的!

2.當然還有你的處理因素各個孔之間的平行也很重要，比如說加藥時，藥物稀釋后混勻，保證每個孔的濃度是一致的!

3.再者加細胞和藥物時，要試驗組和對照組一塊輪流加，避免加樣先后順序導致細胞密度和藥物濃度的差異。