很多科研小伙伴在培養(yǎng)細(xì)胞過程中，可能都有過這樣的經(jīng)歷：辛苦呵護(hù)的細(xì)胞，怎么也不愿意貼壁;貼壁了又很容易成塊或者成團(tuán)掉下來;原本貼壁的細(xì)胞，復(fù)蘇后細(xì)胞不貼壁了等各種細(xì)胞不貼壁問題，那么遇到這些問題，該如何解決?

培養(yǎng)細(xì)胞時如果出現(xiàn)不貼壁現(xiàn)象，其原因是多方面的，在分析細(xì)胞不貼壁的原因及解決方法之前，我們先來看下什么是貼壁細(xì)胞?貼壁細(xì)胞原理?細(xì)胞貼壁和什么有關(guān)?為啥你的細(xì)胞不愿貼壁呢?如何促進(jìn)細(xì)胞貼壁?

細(xì)胞不貼壁原因分析及解決方法

根據(jù)細(xì)胞特性分類

1. 懸浮細(xì)胞(Suspension Cell)

細(xì)胞生長不依賴支持物表面，在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長，如淋巴細(xì)胞。

2. 貼壁細(xì)胞(Adherent Cell)

在動物細(xì)胞培養(yǎng)過程中，必須有可以貼附的支持物表面，依靠自身分泌或培養(yǎng)基中的粘附因子才能在該表面生長增殖的細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞在該表面生長后，一般形成兩種形態(tài)，即成纖維樣細(xì)胞或上皮樣細(xì)胞。

細(xì)胞形態(tài)

3.兼性貼壁細(xì)胞

有些細(xì)胞并不嚴(yán)格地依賴支持物，它們既可以貼附于支持物表面生長，但在一定條件下，也可在培養(yǎng)基中呈懸浮狀態(tài)生長。

貼壁細(xì)胞分為：上皮細(xì)胞型，成纖維細(xì)胞型，游走細(xì)胞型和多型細(xì)胞型，在顯微鏡下觀察時，貼壁細(xì)胞在瓶底伸展并延伸成梭型或不規(guī)則的三角形或扇形或其他形態(tài)，而且晃動培養(yǎng)液時，細(xì)胞不動。常見的貼壁細(xì)胞有成纖維細(xì)胞、骨骼組織(骨及軟骨)、心肌與平滑肌、肝、肺、腎、乳腺皮膚、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞、黑色素細(xì)胞以及各種腫瘤細(xì)胞等。

體外培養(yǎng)貼壁細(xì)胞特點(diǎn)

貼附并伸展，是多數(shù)體外培養(yǎng)細(xì)胞的基本生長特點(diǎn)。細(xì)胞貼壁的過程使形態(tài)發(fā)生很大變化，細(xì)胞形態(tài)改變是細(xì)胞內(nèi)骨架(真核細(xì)胞中的蛋白纖維網(wǎng)架體系，由微管、微絲及中間纖維組成的體系)本身和細(xì)胞外基質(zhì)共同作用的結(jié)果。培養(yǎng)細(xì)胞在未貼附于底物之前一般均似球體樣，當(dāng)與底物貼附后，細(xì)胞將逐漸伸展而形成一定的形態(tài)，呈成纖維細(xì)胞樣或上皮細(xì)胞樣等。細(xì)胞附著于底物時并非一種需要能量的過程，一般認(rèn)為與電荷有關(guān)。據(jù)資料記載，37℃時在2min內(nèi)細(xì)胞之間即可形成鍵，該鍵可對0.01%胰蛋白酶起作用且僅發(fā)生于細(xì)胞間，細(xì)胞與底物之間則無;8min后才有穩(wěn)定的鍵形成。

貼壁細(xì)胞(除腫瘤細(xì)胞外)在體外培養(yǎng)條件下，完成貼壁后均為單層生長，原因是貼壁細(xì)胞有接觸性抑制的特點(diǎn)。一般認(rèn)為接觸抑制是細(xì)胞間的一種識別作用，對于動物細(xì)胞的形態(tài)形成與穩(wěn)定具有重要性的作用。由于貼壁細(xì)胞的一面是緊貼在培養(yǎng)瓶上的，如果其上方存在細(xì)胞與其相粘附，那么下方的細(xì)胞很快就會缺乏營養(yǎng)——餓死。

接觸抑制

1954年，由艾伯克龍比發(fā)現(xiàn)，一些細(xì)胞在生長過程中達(dá)到相互接觸時停止分裂現(xiàn)象，將其命名為接觸性抑制(Contact Inhibition)，后來證實(shí)接觸性抑制普遍存在于貼壁細(xì)胞之間。

接觸抑制的原理：細(xì)胞膜上有糖類和蛋白質(zhì)共同構(gòu)成的糖蛋白，也叫做糖被，它在細(xì)胞上起識別作用，當(dāng)細(xì)胞增殖到一定程度，挨在一起時，糖蛋白就會識別這種信號，并且使細(xì)胞停止繁殖。

單層生長

細(xì)胞為什么要貼壁

首先并不是所有的細(xì)胞在體外培養(yǎng)的情況下都會貼壁，但大部分來自實(shí)體組織器官的細(xì)胞都會貼壁。

密度大于培養(yǎng)基的細(xì)胞(絕大部分細(xì)胞)通過重力作用會沉降在底面上，這是種自然屬性，那么細(xì)胞要生存必定得改善這個環(huán)境，也是貼壁的主要原因——分泌細(xì)胞外基質(zhì)和粘附因子(Extracellular matrix& Cell Adhesion Molecules，ECM&CAM)，改善底面的結(jié)構(gòu)，然后很自然就貼附在底面上了。

細(xì)胞粘附分子

是眾多介導(dǎo)細(xì)胞間或細(xì)胞與細(xì)胞外間相互接觸和結(jié)合分子的統(tǒng)稱。

細(xì)胞外基質(zhì)

是由動物細(xì)胞合并分泌到胞外、分布在細(xì)胞表面或細(xì)胞之間的大分子。

二者大多數(shù)均為糖蛋白，因此具有較強(qiáng)的親水性——因此能不能貼壁不僅僅關(guān)乎細(xì)胞是否有這種能力，也與有無合適的底物(培養(yǎng)瓶)有關(guān)。

原理圖

密度小于水的細(xì)胞，如脂肪細(xì)胞，漂浮在液面上，所以不可能貼在底面上，但是如果將培養(yǎng)液加滿，那么細(xì)胞能夠與培養(yǎng)瓶上面的壁接觸同樣可以貼壁。因此可以說，細(xì)胞貼壁是適應(yīng)環(huán)境的一種反應(yīng)。

細(xì)胞貼壁原理及相關(guān)因素

大多數(shù)的哺乳動物細(xì)胞在體內(nèi)和體外均附著于一定的底物而生長，在體外時這些底物可以是其他細(xì)胞、膠原、玻璃或塑料等。

貼壁的過程：細(xì)胞首先分泌細(xì)胞外基質(zhì)，這種細(xì)胞外基質(zhì)黏附在支持物的表面(培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)皿的底面)。然后，細(xì)胞通過其表面表達(dá)的黏附因子與這些細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合。

貼壁過程

一些特殊的促細(xì)胞附著物質(zhì)(如層粘連蛋白、纖維連接蛋白、Ⅲ型膠原、血清擴(kuò)展因子等)可能參加細(xì)胞的貼附過程。這些促細(xì)胞附著因子均為蛋白質(zhì)，存在于培養(yǎng)液尤其是血清中。在培養(yǎng)過程中，這些帶陽電荷的促貼附因子先吸附于底物上，懸浮的圓形細(xì)胞再與已吸附的有促貼附物質(zhì)的底物附著，以后細(xì)胞將伸展成其原來的形態(tài)。所以細(xì)胞貼壁與否和細(xì)胞本身分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力以及細(xì)胞本身表達(dá)的黏附分子的數(shù)量有關(guān)，也與培養(yǎng)皿壁的表面結(jié)構(gòu)有關(guān)。

在細(xì)胞培養(yǎng)過程中會出現(xiàn)這樣或那樣的問題，這些問題從細(xì)胞生長角度來說，針對細(xì)胞不貼壁、生長緩慢、生長不好，甚至死亡的原因，我們做以下分析并提出相對應(yīng)的解決方法。

細(xì)胞不貼壁的一些原因

1) 胰酶消化時間把控不當(dāng)：消化不夠細(xì)胞本身就是成團(tuán)的;若胰酶處理太久，容易造成細(xì)胞膜蛋白損傷，使細(xì)胞貼壁不緊，顯微鏡下觀察立體感不強(qiáng)，嚴(yán)重的時候甚至?xí)斐杉?xì)胞死亡。

2) 缺少貼壁因子：血清中含有促貼壁因子，而無血清培養(yǎng)基工藝中由于缺少這種促貼壁因子，細(xì)胞的貼壁效果會下降很多。

3) 支原體或細(xì)菌的污染。

4) 培養(yǎng)液配制、儲存不當(dāng)，如pH值過堿，Gln量太少等原因。

5) 復(fù)蘇的細(xì)胞本身狀態(tài)不好，已經(jīng)老化，失去貼附性。

6)接種細(xì)胞數(shù)目太少，無法分泌足夠的細(xì)胞外基質(zhì)。

7) 復(fù)蘇時處理速度太慢，復(fù)蘇過程不當(dāng)。

如何促進(jìn)細(xì)胞貼壁

1)適度消化細(xì)胞：HepG-2、A549、Hela、SGC-7901幾種癌細(xì)胞處理時間可適當(dāng)放長，一般處理5-6min，C2C12、COS-7、NIH-3T3比較容易脫落，2min足矣，P19Cl6和293細(xì)胞貼壁不緊，可在PBS漂洗后，直接換新鮮培養(yǎng)基打散。

2)最好用塑料瓶培養(yǎng)，如果是玻璃瓶，那么可以用鼠尾膠原包被一下培養(yǎng)瓶，或者用鹽酸對培養(yǎng)瓶進(jìn)行蝕刻，或者涂Laminin/fibronectin/collagen/BSA，也可以幫助細(xì)胞貼附新的培養(yǎng)瓶，細(xì)胞不易貼壁，建議加多聚賴氨酸處理。

3)正確配制消化液或培養(yǎng)液。

4)使用合適的細(xì)胞外基質(zhì)或貼壁試劑。

5) 復(fù)蘇新的細(xì)胞。

6)傳代接種一定要鋪的均勻，避免細(xì)胞抱團(tuán)生長。

7)細(xì)胞傳代24小時之內(nèi)，最好不要晃動，以免影響貼壁。

8) 體內(nèi)上皮細(xì)胞生長在膠原構(gòu)成的基膜上，因此培養(yǎng)在有膠原的底物上有利于生長。人或小鼠表皮細(xì)胞培養(yǎng)，可以用γ射線照射后的3T3細(xì)胞為飼養(yǎng)層，另外降低pH、Ca2+含量和溫度，均有利于上皮細(xì)胞生長。

懸浮細(xì)胞成簇可能原因

1)培養(yǎng)液中含鈣、鎂離子;

2)支原體污染;

3)蛋白酶過度消化使得細(xì)胞裂解;

4)DNA污染 。

懸浮細(xì)胞成簇解決方法

1)用無鈣鎂平衡鹽溶液洗滌細(xì)胞，輕巧吹吸細(xì)胞獲得單細(xì)胞懸液;

2)分離培養(yǎng)物，檢測支原體;

3)用DNaseI處理細(xì)胞。

培養(yǎng)細(xì)胞生長緩慢可能原因

細(xì)胞長得慢是細(xì)胞培養(yǎng)過程中比較常見的問題，一般來說，細(xì)胞活力和濃度一直是細(xì)胞健康的標(biāo)志，細(xì)胞長得慢的話，活力和濃度可能都會直線下降。

1)由于更換不同培養(yǎng)液或血清;

2)培養(yǎng)液中一些細(xì)胞生長必需成分如谷氨酰胺或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞;

3)培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染;

4)試劑保存不當(dāng);

5)接種細(xì)胞起始濃度太低;

6)細(xì)胞已老化;

7)支原體污染 。

培養(yǎng)細(xì)胞生長緩慢解決方法

1)比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)，讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液;

2)換入新鮮配置培養(yǎng)液，或補(bǔ)加谷氨酰胺及生長因子;

3)用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄培養(yǎng)物;

4)血清需保存在-10到-20℃。培養(yǎng)液需在2-8℃避光保存。含血清完全培養(yǎng)液在2-8℃保存，需在1周內(nèi)用完;

5)增加接種細(xì)胞起始濃度;

6)換用新的保種細(xì)胞。細(xì)胞老化(cellular aging)是細(xì)胞隨生物體年齡增長而發(fā)生退行性變化的綜合，如果傳代前細(xì)胞已匯合就會導(dǎo)致其失去黏附性。可以復(fù)蘇新的保種細(xì)胞，重新進(jìn)行培養(yǎng)。

7)分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。

培養(yǎng)細(xì)胞生長不好可能原因

1)細(xì)胞本身的狀態(tài);

2)細(xì)胞傳代次數(shù)多，細(xì)胞老化;

3)細(xì)胞的接種量：接種量過低，細(xì)胞生長緩慢;

4)細(xì)胞傳代時間過晚：細(xì)胞中毒，影響傳代后的細(xì)胞生長;

5)胰酶消化時間過長或過短：時間過長，細(xì)胞死亡;時間過短，細(xì)胞未完全分離而成團(tuán)，細(xì)胞死亡;

6)細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇：慢凍速融;

7)污染：支原體污染、霉菌污染;

8)培養(yǎng)基或血清;

更換血清或培養(yǎng)基之前未進(jìn)行驗(yàn)證;

選擇的培養(yǎng)基是否合適;

培養(yǎng)基配制是否準(zhǔn)確無誤。

9)培養(yǎng)環(huán)境

CO2供應(yīng)是否正常;

培養(yǎng)箱或搖床溫度控制是否正確。

培養(yǎng)細(xì)胞生長不好解決方法

根據(jù)以上可能原因，做出針對性的解決方案

1)注意細(xì)胞的本身狀態(tài)：如傳代次數(shù)、接種量等;

2)避免產(chǎn)生污染(用正規(guī)、合法、可溯源的血清);

3)要用合適的血清或培養(yǎng)基，最好經(jīng)過驗(yàn)證;

4)注意實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境。細(xì)胞對環(huán)境比較敏感，如果操作人員不注意衛(wèi)生、或工作環(huán)境及實(shí)驗(yàn)器材出現(xiàn)污染都會導(dǎo)致細(xì)胞間的交叉污染，出現(xiàn)不貼壁現(xiàn)象。如果發(fā)現(xiàn)支原體污染，及時丟棄培養(yǎng)物。

培養(yǎng)細(xì)胞死亡可能原因

1)培養(yǎng)箱內(nèi)無CO2;

2)培養(yǎng)箱內(nèi)溫度波動太大;

3)細(xì)胞凍存或復(fù)蘇過程中損傷;

4)培養(yǎng)液滲透壓不正確;

5)培養(yǎng)液中有毒代謝產(chǎn)物堆積 。

培養(yǎng)細(xì)胞死亡解決方法

1)檢測培養(yǎng)箱內(nèi)CO2;

2)檢查培養(yǎng)箱內(nèi)溫度;

3)取新的保存細(xì)胞種;

4)檢測培養(yǎng)液滲透壓;

5)換入新鮮培養(yǎng)液。

細(xì)胞產(chǎn)品是我們做實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)，一支小小的細(xì)胞，關(guān)乎我們各種實(shí)驗(yàn)的成功與否，細(xì)胞的”小事情“，在實(shí)驗(yàn)中都是”大事情“，如果你的細(xì)胞出現(xiàn)生長緩慢、不貼壁等情況，那你可要注意了，這就是細(xì)胞狀態(tài)不好的信號，要及時“挽救”，不然很有可能細(xì)胞就瀕臨死亡。

總之，養(yǎng)細(xì)胞需要耐心，要溫柔，使用品質(zhì)良好的細(xì)胞株和培養(yǎng)基是減少污染的最好方法，同時也是保證細(xì)胞生長良好的前提。