細胞系STR鑒定細胞系鑒定(Cell Line Authentication)是指對廣泛應(yīng)用于科學研究和藥物開發(fā)的模式細胞進行鑒定。在科學研究過程中，如果使用了交叉污染或錯誤辨識的細胞將導致研究結(jié)論錯誤、結(jié)果不可重復、臨床細胞治療災(zāi)難性后果等嚴重問題出現(xiàn)。Nature等機構(gòu)近年發(fā)出呼吁，要求研究者對細胞進行鑒定，以確保實驗數(shù)據(jù)的準確性。給細胞系進行驗明正身，已成為開展科研工作的首要任務(wù)。STR鑒定目前已被ICLAC、ATCC等權(quán)威機構(gòu)作為金標準應(yīng)用于細胞鑒定越來越多的雜志要求在投稿時提供細胞STR分裂數(shù)據(jù)。

那么，在細胞系STR鑒定有哪些常見問題

1. 什么是細胞系鑒定

所謂細胞系鑒定即通過STR(短串聯(lián)重復)圖譜所建立細胞系的遺傳特征。一株細胞系的遺傳特征確立后，細胞系以通過定期的檢測，以防止出現(xiàn)細胞系被誤認或交叉污染的情況。

2.細胞系鑒定服務(wù)流程

STR基因位點由長度為3～7個堿基對的短串連重復序列組成， 這些重復序列廣泛存在于人類基因組中，可作為高度多態(tài)性標記，被稱為細胞的DNA指紋。STR 基因座位上的等位基因可通過擴增區(qū)域內(nèi)重復序列的拷貝數(shù)的不同來區(qū)分，在毛細管電泳分離之后可通過熒光檢測來識別。隨后通過一定的計算方法，即可根據(jù)所得的STR分型結(jié)果與細胞STR數(shù)據(jù)庫比對從而推算出樣品所屬的細胞系或可能的交叉污染的細胞系名稱。

3.細胞系STR鑒定發(fā)展歷程

一個細胞系，從分離組織到獲得一種新的細胞系開始，就應(yīng)該具有其起源等的詳細資料，隨著細胞系成為科學研究中重要的工具，所使用的細胞系的真實性、是否發(fā)生交叉污染等問題變得越來越重要。顯然，科學家們開始并未意識到這個問題的嚴峻性，以下是細胞系STR鑒定的發(fā)展歷程，直到今天，還有許多錯誤鑒定和交叉污染的細胞株，甚至科學家們使用了不正確的細胞系，嚴重影響了實驗結(jié)果的真實性。

2001年 PNAS發(fā)文Short tandem repeat (STR)profiling provides an international reference standard for human cell lines指出STR分型技術(shù)為人類細胞系的鑒定提供了國際參考標準。

2007 年一份生物儲存庫材料審核結(jié)果表明，三分之一或更多的細胞系被錯誤鑒定或受到污染;NIH發(fā)布了通知，強烈建議在使用培養(yǎng)細胞的時候進行鑒定(authentication)。

2008 年底，專家提議ATCC致力于人源細胞系的鑒定工作，并制定鑒定的標準程序。

2009年 Nature發(fā)文Identity crisis：It is time for all involved to tackle the chronic scandal of cell-line contamination。

2010年 Nat Rev Cancer ——Cell line misidentification：the beginning of the end。

2011年美國菌種保藏中心(ATCC)制定了人源細胞系STR鑒定標準ANSI Authentication of Human Cell Lines：Standardization of STR Profiling。

2012年Nature發(fā)文Cell-line authentication：End the scandal of false cell lines說明了細胞系鑒定的重要性。

2013年Nature旗下雜志要求作者需注明研究中細胞系的來源，避免科學研究因為細胞系有誤得出不正確的結(jié)果。

2014年12月、2015年2月Science雜志分別發(fā)表專題文章，闡述細胞交叉污染和錯誤辨識的嚴重性。

2015年4月，Nature旗下所有雜志將要求作者鑒定論文中所用細胞系。

2015年6月即有報道稱一科學家因細胞系污染，被Nature撤銷發(fā)表于其上的論文。

2016年4月中國科學院昆明細胞庫公布共60株錯誤鑒定和交叉污染的細胞系。

4.為什么要進行細胞系鑒定

首先進行細胞系STR鑒定是很重要的。很多生物醫(yī)藥的研究都采用培養(yǎng)細胞來進行，這些細胞可能是受贈于其它研究人員，也可能是從細胞庫(如美國ATCC ,American Type Culture Collection)得來。 據(jù)估計，15-20%的實驗室， 實驗中所使用的細胞已經(jīng)不是原來的細胞系，或者與其它細胞系發(fā)生了交叉污染。顯然，細胞系遭到污染、特征鑒別錯誤，將會極大的威脅著基于這些細胞而發(fā)表的論文質(zhì)量和研究發(fā)現(xiàn)的正確性。為此，很多細胞庫現(xiàn)在都要對提交來的細胞系進行鑒定，并對細胞系之間的交叉污染進行監(jiān)測。

現(xiàn)在很多機構(gòu)都已經(jīng)認識到這個的重要性，ATCC和FDA,這些機構(gòu)要求對用于制藥領(lǐng)域的實驗中所使用的材料，如細胞系，應(yīng)該進行“身份鑒定和純度測試。很多雜志也要求使用細胞系的文章提供STR指紋圖譜數(shù)據(jù)。FDA建議研究人員在培養(yǎng)細胞的較早階段(細胞培養(yǎng)第一周)來鑒定細胞系的身份。細胞在被凍存前應(yīng)再一次進行鑒定; 對于活躍生長的細胞，每兩個月應(yīng)鑒定一次;文獻發(fā)表前也應(yīng)對細胞系身份進行鑒定。如果一個實驗室使用不止一種細胞系，則應(yīng)在實驗最開始時，就要對所有的細胞系進行鑒定，以便排除交叉污染。這樣將減少由于細胞系發(fā)生交叉污染或身份誤認，將導致實驗數(shù)據(jù)的無效或數(shù)據(jù)誤導。

由于細胞系發(fā)生交叉污染或身份誤認，將導致實驗數(shù)據(jù)的無效或數(shù)據(jù)誤導。NIH已發(fā)出公告，討論細胞系鑒定的必要性與重要性，并且越來越多的的期刊要求文章發(fā)表前、需提供細胞鑒定數(shù)據(jù)。

目前要求提供細胞鑒定數(shù)據(jù)的期刊有：

Nature

Nature Cell Biology

Nature Methods

AACR Journals

Cancer Research

Clinical Cancer Research

Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention，CEBP

Cancer Prevention Research

Molecular Cancer Research

Molecular Cancer Therapeutics

Cancer Reviews Online

Prevention Portal

Cancer Discovery

Cancer Immunology Research

International Journal of Cancer

Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism

Journal of Endocrinology

Journal of Molecular

Journal of Molecular Biology

Journal of the National Cancer Institute

BioTechniques

Carcinogenesis

Cell Biochemistry and Biophysics

Cell Biology International

Clinical Orthopaedics and Related Research

Endocrine Reviews

Endocrine-Related Cancer

Endocrinology

In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal

Molecular Endocrinology

Molecular Vision

Neuro-Oncology

PLoS ONE……

5. 細胞系用錯的概率有多大

據(jù)ATCC估計，1977年錯誤使用細胞的概率是16%，1999年是18%。根據(jù)我們的經(jīng)驗，國內(nèi)細胞系用錯的概率不低于20%;即如果一個研究所有二十個課題組，按概率估計，有4個課題組用的細胞是錯的。

6. 什么時候需細胞系鑒定

1) 當建立或獲得一個新的細胞系時

2) 一個涉及到細胞試驗項目開始/結(jié)束時

3) 在細胞凍存之前，或細胞已連續(xù)培養(yǎng) 2～3 個月時

4) 發(fā)表文章或申請課題經(jīng)費前

5) 細胞系表現(xiàn)不穩(wěn)定或結(jié)果與預期差別較大時

6) 當實驗室使用超過一種細胞系時，所有細胞系最好先鑒定以排除交叉污染的可能

7.細胞STR鑒定技術(shù)原理

由于STR技術(shù)具有靈敏度高(最低可檢出0.1ng DNA)、自動化程度高、準確快速、重復性好等優(yōu)點， STR基因分型已被作為金標準應(yīng)用于細胞鑒定。

STR(Short Tandem Repeat，短串聯(lián)重復序列)基因位點由長度為3～7個堿基對的短串連重復序列組成，這些重復序列廣泛存在于人類基因組中，可作為高度多態(tài)性標記，被稱為細胞的DNA指紋。STR已被廣泛應(yīng)用于親子鑒定、個體識別、司法鑒定、交通事故鑒定、(造血干細胞)移植治療后嵌合情況監(jiān)測等領(lǐng)域。STR基因座位上的等位基因可通過PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))擴增區(qū)域內(nèi)重復序列的拷貝數(shù)的不同來區(qū)分，在毛細管電泳分離之后可通過熒光檢測來識別，隨后通過一定的計算方法，即可根據(jù)所得的STR分型結(jié)果與專業(yè)的細胞STR數(shù)據(jù)庫比對從而推算出樣品所屬的細胞系或可能的交叉污染的細胞系名稱。

8.有些細胞系是自己實驗室發(fā)現(xiàn)的，在ATCC等細胞庫中沒有入庫，能否做細胞鑒定

能，雖然在數(shù)據(jù)庫中沒有其STR數(shù)據(jù)，但我們?nèi)越ㄗh您進行細胞STR鑒定，因為我們的試劑盒是針對基因的多態(tài)性位點進行擴增，無論是哪個種屬的細胞均能得到擴增，另外通過該項檢測，您可以：

1)判斷培養(yǎng)的細胞是否被其他細胞交叉污染及其可能被污染的細胞名稱;

2)您將是第一個得到該細胞系STR數(shù)據(jù)(DNA指紋)的人;

3)申請將該細胞系的STR數(shù)據(jù)保存于權(quán)威的數(shù)據(jù)庫中。

9.可以對哪些物種進行細胞鑒定

人源的細胞系(包括人干細胞)和小鼠的細胞系在實驗室中最為常見，我們主要針對這兩種細胞進行鑒定;另外，還可以鑒定人源細胞中的鼠源細胞污染，鑒定猴源的細胞;目前正在開發(fā)豬、狗的細胞鑒定體系。

10.如何提供鑒定樣本

每種細胞需單獨收集在 1.5ml 離心管中，細胞數(shù)目不少于 10的6次方個。細胞需要離心沉淀，并且以 PBS 清洗盡可能去除上清培養(yǎng)基，沉淀沉淀進行冰凍保存與寄送。

11. 如何知道細胞系是否發(fā)生交叉污染了

如果存在細胞系之間發(fā)生交叉污染，而且鑒定用的細胞可能有兩種以上的細胞系時，那么在進行 STR 位點檢測的時候，多個位點會出現(xiàn)兩個以上的峰。峰高值表示該等位基因的信號強度，理論上峰值與樣本的 DNA 濃度有直接的關(guān)系。因此，存在交叉污染的混合細胞系中，其中一個位點中某些峰會明顯高于其他的峰，其中大峰是屬于混合細胞系中那個主要細胞系，而小峰則屬于那個次要細胞系。

值得注意的是，當發(fā)生兩個或以上細胞混合的時候，檢測結(jié)果看起來非常像細胞系的“遺傳不穩(wěn)定”——當一個細胞系存在亞群時，尤其是一些癌細胞系， 由于遺傳不穩(wěn)定的存在，在一些位點的 STR 特性會不同。因此經(jīng)驗豐富的分子專家是非常重要的，他能夠幫助分析復雜的電泳圖譜(STR 峰圖)，從而判斷是否由于發(fā)生細胞系交叉污染而導致多等位基因情況。

12. 如何根據(jù) STR 數(shù)據(jù)判斷細胞系的身份

收到細胞系鑒定結(jié)果以及 STR 信息，可以與參考數(shù)據(jù)庫進行比對。如果細胞樣本的每個 STR 位點和參考細胞 STR 位點都能重合匹配，即說明該細胞系正確，反之則說明你的細胞系可能被錯誤標記，交叉污染或發(fā)生遺傳不穩(wěn)定。一般說來，匹配度≥80%即可認為該細胞系正確，匹配度<80%則說明該細胞系的來源需要被懷疑。

如果細胞系被鑒定出發(fā)生交叉污染或錯誤標記，則需要拿更早代數(shù)的細胞進行鑒定，從而找到問題的起源或者直接從可靠的機構(gòu)購買一株新的細胞系。

13. 如果細胞系沒有在數(shù)據(jù)庫中比對出結(jié)果怎么辦

如果已知數(shù)據(jù)庫中沒有找到你的細胞信息，你可以用自己的細胞遺傳信息建立自己的遺傳特性，以便后期進行自己細胞庫的比對。

14.為什么報告內(nèi)最終結(jié)論，會出現(xiàn)匹配不上任何已知數(shù)據(jù)情況

最大的可能性是因為這株細胞的標準序列并沒有收錄在國際的細胞庫之中，導致送檢樣本與任何的序列都不匹。出現(xiàn)這種情況大多數(shù)是因為該細胞系，可能是由國內(nèi)課題組自主建系的。

15.在做細胞STR檢測時為什么選擇的位點有些并未出現(xiàn)在ATCC、JCRB、DSMZ等數(shù)據(jù)庫中

目前這些數(shù)據(jù)庫中發(fā)布的都是9位點比對，且這9個位點相同。為了更好的進行細胞分型，鑒定是否被污染，除選擇標準的9個位點以外，還設(shè)計鑒定其他位點，追求更高的準確性。

16. 細胞系交叉污染或錯誤鑒定對研究是否有影響

答案是肯定的。使用錯誤的細胞系或者是被污染的細胞系做研究，只會造成時間，金錢和精力的損失，以及造成實驗結(jié)果的不一致和不可重復。因此如果用被污染或錯誤的細胞系做研究，在發(fā)表文章或做進一步研究時極有可能需要用正確的細胞再重復實驗。

17. 用錯細胞時間最長的持續(xù)了多少時間

瑞典有一個科學家，在三十年的時間里都以為自己的細胞是正確的，直到做了細胞鑒定之后發(fā)現(xiàn)是錯誤的。越早發(fā)現(xiàn)錯誤越好，鑒定之后是正確的話，自己也放心。

18. 為什么報告內(nèi)最終結(jié)論，會出現(xiàn)匹配不上任何已知數(shù)據(jù)情況

最大的可能性是因為這株細胞的標準序列并沒有收錄在國際的細胞庫之中，導致送檢樣本與任何的序列都不匹。出現(xiàn)這種情況大多數(shù)是因為該細胞系，可能是由國內(nèi)課題組自主建系的。

19. 國內(nèi)有類似的 STR 標準數(shù)據(jù)庫嗎

是有的，這個是協(xié)和醫(yī)院官方建立的一個國家實驗細胞資源共享平臺，cellresource.cn / 在里面約會收錄一些國內(nèi)自主建系的細胞的標準序列。

20. 對于STR位點引物設(shè)計有什么要求嗎

設(shè)計其實很簡單，并且很容易使用。但是由于這個位點的選擇和優(yōu)化是非常枯燥并且耗時耗力的工作，建議由專業(yè)的服務(wù)方進行設(shè)計和合成。

21. 除了檢測人源的細胞株，還可以檢測其他動物的細胞或者原代細胞嗎

技術(shù)上是可以檢測的。但是鼠源細胞在結(jié)果上跟人源細胞有明顯的區(qū)別。鼠源一個 STR 位點會出現(xiàn)上百個重復，只能證明待測樣本不是人源的樣本。但是屬于小鼠的具體哪一種細胞株，無法確定，因此也不能排除鼠源細胞之間出現(xiàn)交叉污染的可能。

至于人的原代細胞，由于國際上的數(shù)據(jù)庫里面沒有收錄原代細胞標準序列，最終的檢測結(jié)果也是匹配不上任何的已知序列的。