外周血單個核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC)是外周血(即除骨髓以外的血液)中具有單個核的細胞的混合細胞群體，包括自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)、T淋巴細胞(70%-90%)、B淋巴細胞。能夠進一步分離純化，是免疫細胞的主要來源。

外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells ，PBMC)是免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分，因此在免疫學、傳染病、惡性腫瘤、疫苗研發(fā)、移植治療、個性化醫(yī)學和毒理學等領(lǐng)域作為最基礎(chǔ)的實驗原料被廣泛使用。

PBMC細胞原理

單個核細胞的體積、形態(tài)和比重與外周血其它細胞不同，紅細胞和多核白細胞的比重超過1.080，單個核細胞的比重為1.070左右，血小板為1.030左右。因此，可利用各種血細胞和單個核細胞比重之間的差異將各種血細胞與單個核細胞分離開來。

從血液制備PBMC是分離特定免疫細胞亞群之前常見的一個步驟。最常用的PBMC分選方法是使用密度梯度離心液進行離心。

Ficoll密度梯度離心法是分離、純化PBMC最常用的方法。Ficoll是蔗糖的多聚體，中性，平均分子量400000，當密度為1.2g/mL，未超出正常生理性滲透壓，也不穿過生物膜，故常用作PBMC分離的分離液。紅細胞、粒細胞比重大，離心后沉于管底;淋巴細胞和單核細胞的比重小于或等于分離液比重，離心后漂浮于分離液的液面上，也可有少部分細胞懸浮在分離液中。吸取分層液液面上的白膜層細胞，并進行適當?shù)那逑?，就可從外周血中分離到較高純度的單個核細胞，即PBMC。

PBMC細胞分離實驗準備注意事項

在開始PBMC分離之前，需要進行充分的實驗準備工作。以下是一些需要注意的事項

1.血液樣本的采集和處理

在進行PBMC分離之前，需要采集血液樣本。采血時應注意以下幾點:首先，要選擇適當?shù)牟裳獣r間，如清晨空腹采血可以提高檢測結(jié)果的穩(wěn)定性;其次，應選擇適當?shù)牟裳绞?，如靜脈采血或動脈采血;最后，應使用適當?shù)目鼓齽﹣硖幚硌簶颖?，以避免血液凝固。在采集血液樣本后，應盡快將樣本送往實驗室進行處理。

2.實驗器材和試劑的準備

在實驗前，需要準備好所需的實驗器材和試劑。應選擇適當?shù)碾x心管、吸管、細胞篩等實驗器材，并確保這些器材的清潔度和無菌狀態(tài)。此外，需要準備適當?shù)姆蛛x介質(zhì)、洗滌液、培養(yǎng)基等試劑，并確保這些試劑的質(zhì)量和濃度符合實驗要求。

將分離液的溫度平衡至室溫(RT)，避光。

樣品準備：抗凝全血或骨髓。根據(jù)樣本濃度狀態(tài)，可適當用生理鹽水稀釋，提高分離效果。

3.操作過程注意事項

在PBMC分離的操作過程中，應注意以下事項

1.離心速度和時間的選擇

離心是PBMC分離的重要步驟之一。在選擇離心速度和時間時，應根據(jù)實驗要求和實際情況進行權(quán)衡。離心速度過高或時間過長可能導致細胞損傷或失活；離心速度過低或時間過短則可能導致分離不充分。因此，需要根據(jù)分離介質(zhì)的特性和所需細胞類型進行選擇和調(diào)整。

2.操作過程的無菌化處理

在PBMC分離過程中，應保持操作的無菌化處理。所有實驗器材和試劑應保持清潔和無菌狀態(tài)，以避免污染和交叉感染。此外，實驗操作應在無菌操作臺或超凈工作臺中進行，并穿戴適當?shù)膫€人防護裝備。

3.細胞的洗滌和處理

在離心后，需要對細胞進行洗滌和處理。應使用適當?shù)南礈煲喝コs質(zhì)和死細胞，并輕輕拍打離心管底部以幫助細胞懸浮和去除雜質(zhì)。在洗滌過程中應避免使用太大的力氣或過多的液體，以免影響細胞的活性或數(shù)量。處理后的細胞應盡快進行后續(xù)實驗或存儲。

PBMC細胞分離方法

1.取新鮮抗凝全血，按照1：1比例加入1×稀釋洗滌液，將血液進行稀釋(以降低血液粘稠度)，輕柔混勻，備用。

2. 向無菌離心管內(nèi)加入適量的單個核細胞分離液，將稀釋后的血樣平鋪到分離液液面上方(分離液：稀釋全血=1：2)，保持兩液面界面清晰。

3. 800g，室溫，離心 20min-30min(注：設置較慢的加速度和減速度，如果有十檔，設為第三檔)。

4. 離心結(jié)束后，吸棄血漿層，小心吸取PBMC層(即白膜層)并轉(zhuǎn)移至15mL離心管中。離心結(jié)束后，管內(nèi)液面從上至下依次為稀釋血漿層、PBMC層、分離液層和紅細胞層(見圖1)。

圖稀釋外周血離心前后的分層狀態(tài)圖

5.向離心管中加入10mL 的1×稀釋洗滌液重懸細胞，250g，室溫離心 10min ，棄上清。重復該步驟 1~2 次，即可用于后續(xù)試驗。

6.細胞活力檢測：死的細胞可被染成藍色，活細胞不著色。計數(shù)200個淋巴細胞。計算出活細胞百分率。活細胞百分率(%)=活細胞數(shù)/總細胞數(shù)(%)。

7.細胞培養(yǎng)：細胞計數(shù)后調(diào)整細胞濃度為2×105/ml培養(yǎng)基，加于六孔板或24孔板中進行培養(yǎng)。

8.細胞收集：將六孔板或二十四孔板中的培養(yǎng)基吸出棄掉，每孔加200μL Trizol，用移液槍將孔壁吹打數(shù)次后，將Trizol轉(zhuǎn)入EP管中。

9.細胞凍存：將收集的細胞放入-80℃冰箱中保存。

PBMC細胞分離注意事項

1.不同種屬動物單個核細胞的比重有一定差異，請選擇合適的分離液進行PBMC的分離。

2.血液新鮮程度是影響分離效果的關(guān)鍵因素，請盡量使用采集后24h內(nèi)的血液進行PBMC分離。

3.為保證細胞的活力，整個操作過程請輕柔，避免對細胞造成機械性的損傷。

4.為保持細胞狀態(tài)良好，請盡量縮短整個試驗的周期。

5.離心后收獲細胞前，也可先吸取采集或丟棄最上層血漿層，有助于防止被血小板污染。

6. 離心后傾倒上清時不要將分離管倒置2s以上。

7.分離管請勿重復使用。