MIA-PACA-2人胰腺癌細胞簡介

MiaPaCa-2細胞由A.Yunis等人于1975年從65歲白人男性胰腺腫瘤組織建系的。MiaPaCa-2細胞是一個亞二倍體人類細胞系，模式染色體數(shù)為61。一個細胞中通常有16至20條標(biāo)記染色體，少數(shù)正常染色體缺失。MiaPaCa-2細胞表達人集落刺激因子I亞類(CSF-I)，纖溶酶原激活劑基因。據(jù)報道，MiaPaCa-2細胞具有約40小時的倍增時間和約19%的軟瓊脂集落形成效率，細胞對天冬酰胺酶敏感。MiaPaCa-2細胞可用于3D細胞培養(yǎng)和癌癥研究。

MIA-PACA-2人胰腺癌細胞產(chǎn)品信息

細胞名稱：MIA-PACA-2人胰腺癌細胞

細胞別稱：MIA-PaCa-2; MIA-PACA-2; MIA-Pa-Ca-2; MIA Paca2; MIA PaCa2; MiaPaCa-2; MIAPACA-2; MiaPaca.2; MiaPaCa2; Miapaca2; MIAPaCa2; MIAPACA2; Mia PACA 2; MIAPaCa-2; PaCa2;人胰腺癌細胞

種屬來源：人

年齡性別：男;65歲

組織來源：胰腺

生長特性：半貼壁生長

細胞形態(tài)：上皮細胞樣

STR位點信息：AMEL：X，X;CSF1PO：10，10;D12S391：19，19;D13S317：12，13;D16S539：10，13;D18S51：12，12;D19S433：15，15;D21S11：29，31.2;D2S1338：25,25;D2S441：14，14;D3S1358：16，16;D5S818：12，13;D6S1043：12，12;D7S820：12，13;D8S1179：16，16;FGA：22，22;Penta D：12，16;Penta E：13，18;TH01：9，10;TPOX：9

保藏機構(gòu)：ATCC; CRL-1420 DSMZ; ACC-733 ECACC; 85062806 JCRB; JCRB00

培養(yǎng)基：90%DMEM+10%FBS+2.5%馬血清+雙抗

培養(yǎng)條件：氣相：95%空氣+5%二氧化碳;溫度：37℃

凍存條件：無血清凍存液，液氮儲存

倍增時間：26 hours (PubMed=25984343); 25.7 +- 4.3 hours (PubMed=27067801); 40 hours, 18 hours, in serum-free medium (PubMed=23386380); ~40 hours (ATCC); ~30-40 hours (DSMZ)

基因表達情況：human colony stimulating factor, subclass I (CSF-I); plasminogen activator

MIA-PACA-2人胰腺癌細胞形態(tài)特征

MIA-PACA-2細胞形態(tài)特征半貼壁生長，上皮細胞樣，可用于3D細胞培養(yǎng)和癌癥研究。

MIA-PACA-2人胰腺癌細胞培養(yǎng)操作說明

細胞培養(yǎng)的基本條件

實驗室條件

1.無菌環(huán)境：無菌室包括更衣室，緩沖間，風(fēng)淋間，操作間

2.儀器設(shè)備：超凈工作臺-操作平臺、CO2培養(yǎng)箱-細胞生長的環(huán)境、倒置顯微鏡-觀察細胞、離心機-離心收集細胞、冰箱-放置培養(yǎng)基等試劑、水浴鍋-復(fù)蘇細胞、真空泵-收集廢液、滅菌鍋-滅菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-凍存細胞、純水儀-制備一級水

3.器材耗材：玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、巴士管、離心管、移液槍、槍頭(白色0-10ul;黃色20-200ul;藍色100-1000ul)、濾器，吸管，多孔培養(yǎng)皿、6cm皿、10cm皿，培養(yǎng)瓶等。

4.試劑：DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、FBS胎牛血清、馬血清、雙抗、胰酶(0.25%Trypsin-0.02%EDTA)、pbs

操作者工作范疇

1.無菌操作：洗手，戴手套，穿實驗服，常噴75%酒精

MIA-PACA-2人胰腺癌細胞復(fù)蘇步驟

1)準(zhǔn)備：紫外線照臺30min，提前打開水浴鍋設(shè)置37℃，培養(yǎng)基臨用前放水浴箱里溫育20分鐘(或者放在超凈工作臺常溫放30min)。在操作臺上擺放好物品，左邊放完全培養(yǎng)液，1mL槍頭(已滅菌)，培養(yǎng)皿，右上角放廢液缸，1mL移液槍，3mL巴氏管。檢查離心機，廢液泵。

2)待水浴鍋溫度達到37℃時，戴上手套和護目鏡，從-196℃液氮罐中取出凍存管，將含有1mLMIA-PACA-2細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，同時不斷輕輕搖動凍存管，盡量保證凍存管內(nèi)細胞1min內(nèi)融化，加4mL培養(yǎng)基混合均勻，移入離心機中100rpm離心3min，以75%酒精噴凍存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。

3)用3mL巴氏管取5mL新鮮培養(yǎng)基到一個新的6cm培養(yǎng)皿中，(若離心后細胞量較多，可取12mL新鮮培養(yǎng)基到一個新的10cm培養(yǎng)皿中)，標(biāo)記日期、所用培養(yǎng)基名稱和細胞名稱。

4)用廢液泵(吸力不要太大)取一個黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取1mL新鮮培養(yǎng)基重懸細胞后(充分混勻)，將MIA-PACA-2細胞懸液加入到培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺上以畫“8”字法鋪勻細胞(一般培養(yǎng)皿在臺子上畫30個8字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測是否鋪勻細胞。

5)確定MIA-PACA-2細胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入CO2培養(yǎng)箱過夜。(盡量平直放入不要晃動)，第二天換液并檢查細胞密度。

MIA-PACA-2人胰腺癌細胞傳代操作

從培養(yǎng)箱拿出MIA-PACA-2細胞，在顯微鏡下觀察細胞密度和細胞狀態(tài)，當(dāng)MIA-PACA-2細胞狀態(tài)良好，且密度達到85%左右的時候即可進行傳代;

打開廢液泵，用廢液泵吸頭(吸力不要太大)取一個藍色槍頭吸走上清廢液，用巴士管取4ml不含鈣、鎂離子的1xPBS(6cm皿)到細胞培養(yǎng)皿中(若是10cm皿則取8ml1xPBS)，輕輕晃動以清洗細胞表面1-2次;

用廢液泵吸走PBS廢液，加1mL消化液(0.25%Trypsin-0.02%EDTA)于培養(yǎng)瓶中，拿起培養(yǎng)皿輕輕轉(zhuǎn)動以便胰酶浸泡到每個細胞，消化1-3min(根據(jù)細胞貼壁情況判斷，貼壁較牢的消化時間長一點或者放入CO2培養(yǎng)箱中消化幾分鐘)后，在顯微鏡下觀察細胞是否變圓變亮，一旦發(fā)現(xiàn)大量細胞胞質(zhì)回縮，細胞間隙增大，即將脫離培養(yǎng)皿底，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

用1ml移液槍輕柔吹打，保證培養(yǎng)皿底的每個角落都吹打到，邊緣處也不能忽略(吹打時盡量避免產(chǎn)生氣泡，因其對細胞有傷害;需輕柔吹打，用力吹打?qū)毎灿袀?，把培養(yǎng)瓶中所有細胞懸液用吸1ml移液槍移入無菌離心管中。

將裝有MIA-PACA-2細胞懸液的離心管放入離心機中(配平)，1000轉(zhuǎn)離心3-5min，用廢液泵取一個黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取1-2mL新鮮培養(yǎng)基重懸細胞后(充分混勻)，將細胞懸液按1:2比例分到新的含8mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺上以畫“8”字法鋪勻細胞(一般培養(yǎng)皿在臺子上畫30個8字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測是否鋪勻細胞。

確定MIA-PACA-2細胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(盡量平直放入不要晃動)。第二天再觀察細胞密度。

MIA-PACA-2人胰腺癌細胞凍存準(zhǔn)備

從培養(yǎng)箱拿出MIA-PACA-2細胞，在顯微鏡下觀察細胞密度和細胞狀態(tài)，待細胞生長狀態(tài)良好且存活率高的狀態(tài)下，細胞密度達80–90%時，可進行細胞凍存操作，以T25瓶為例

MIA-PACA-2細胞凍存步驟

a.收集mia paca-2細胞系及細胞培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶內(nèi)所有培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無菌離心管，裝入無菌離心管中，1000rpm條件下離心4min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數(shù)。

b.根據(jù)細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，在MIA-PACA-2細胞凍存管上貼上細胞標(biāo)簽(細胞標(biāo)簽上包含：細胞名稱、凍存日期、培養(yǎng)用的培養(yǎng)基)。

c.將凍存管入庫到-80度凍存盒里，放置24小時后，即可移入液氮中保存，標(biāo)記好入庫位置和凍存日期。

MIA-PACA-2人胰腺癌細胞培養(yǎng)常見問題

1.MIA-PACA-2人胰腺癌細胞收到貨細胞縮回圓形?

Mia-paca-2細胞對培養(yǎng)條件極為敏感，不可脫離培養(yǎng)箱太久，否則細胞形態(tài)會由梭形形態(tài)縮回圓形，運輸過程中容易掉落，故在查看狀態(tài)時，建議及時盡快放回培養(yǎng)箱。

2.MIA-PACA-2人胰腺癌細胞換液注意事項?

MIA-PACA-2細胞在換液時，培養(yǎng)液需要恢復(fù)至常溫后換液，但是也容易回縮，重新恢復(fù)狀態(tài)至少需要24小時。

3.MIA-PACA-2細胞消化之后成團?

MIA-PACA-2細胞容易堆疊生長，消化時盡量消化為單顆，該細胞形態(tài)偏梭形，匯合度在90%即可傳代。

4.MIA-PACA-2細胞有許多漂浮的細胞，需要收集起來嗎?

MIA-PACA-2細胞為半貼壁細胞，若細胞漂浮太多，需收集上清重新鋪回皿中。

MIA-PACA-2人胰腺癌細胞應(yīng)用

探討長鏈非編碼RNA Linc00152對人胰腺癌細胞株MIA PaCa-2增殖、侵襲和遷移能力的影響。

方法：于醫(yī)院膽胰科采集到20對胰腺癌組織和其對應(yīng)的癌旁正常的胰腺組織;人正常胰腺細胞HPDE及各組胰腺癌細胞系MIA PaCa-2細胞、BxPC-3細胞、Capan2細胞購于美國ATCC細胞庫。實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)驗證組織及各組細胞中Linc00152的表達水平。

人胰腺癌細胞株MIA PaCa-2細胞隨機分為陰性對照組(si-NC組)和Linc00152下調(diào)組(si-Linc00152組)。設(shè)計Linc00152的siRNA(small interfering RNA)干擾模型,si-NC組和si-Linc00152組分別轉(zhuǎn)染陰性對照序列(Negative control)、siRNA抑制序列,采用RT-qPCR驗證兩組MIA PaCa-2細胞中Linc00152的轉(zhuǎn)染效率并進行后續(xù)實驗。

采用CCK-8法和集落形成實驗檢測兩組MIA PaCa-2細胞的增殖能力;流式細胞術(shù)檢測兩組MIA PaCa-2細胞的細胞周期;Western-blot檢測兩組胰腺癌細胞MIA PaCa-2的細胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1、CDK4的表達:

采用Transwell實驗和細胞劃痕實驗測兩組MIA PaCa-2細胞的侵襲、遷移能力;Western-blot檢測兩組MIA PaCa-2的細胞相關(guān)蛋白vimentin及N-cadherin的表達水平。結(jié)果:與癌旁正常的胰腺組織相比,Linc00152在胰腺癌組織中表達明顯增加(P<0.001),Linc00152在胰腺癌細胞系中的表達均高于人正常胰腺細胞HPDE,且在MIA PaCa-2中表達最高(P<0.01)。

成功設(shè)計siRNA干擾模型,將陰性對照序列、siRNA抑制序列轉(zhuǎn)染48 h后,RT-qPCR結(jié)果顯示,與對照組si-NC組對比,si-Linc00152組中的Linc00152表達明顯降低(P<0.01)。分別于6 h、24 h、48 h、72 h、96 h加CCK-8溶液測兩組MIA PaCa-2的細胞活力,結(jié)果與si-NC組相比,si-Linc00152組中的細胞在48 h、72 h、96 h增殖顯著下降(P<0.01)。

集落形成實驗8天后,si-NC組的集落形成數(shù)目是(412±12),而si-Linc00152組的集落形成是(226±8),結(jié)果顯示沉默Linc00152后細胞克隆數(shù)目明顯減少(P<0.01)。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示沉默Linc00152后,與si-NC組相比,si-Linc00152組MIA PaCa-2在細胞周期中的G0/G1期百分比上升,提示發(fā)生了細胞周期阻滯(P<0.01)。

Transwell侵襲實驗顯示,沉默Linc00152后細胞侵襲的數(shù)目明顯減少(P<0.01)。Transwell遷移實驗中顯示,沉默Linc00152后細胞遷移的數(shù)目明顯減少(P<0.01)。細胞劃痕實驗結(jié)果均顯示,與對照組si-NC組對比,si-Linc00152組中細胞遷移,侵襲能力也顯著降低(P<0.01)。

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