BT-474人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞簡(jiǎn)介

BT-474細(xì)胞是由E·Lasfargues和W·G·Coutinho從一名60歲白人女性乳腺癌患者實(shí)心的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中分離到的細(xì)胞株。BT-474[BT474]細(xì)胞可以用于3D細(xì)胞培養(yǎng)和癌癥研究。

BT-474人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞形態(tài)特征

BT-474細(xì)胞呈島狀/片狀生長(zhǎng)：這是該細(xì)胞的特性，是正?，F(xiàn)象，并不是細(xì)胞發(fā)生“聚團(tuán)”，無(wú)需擔(dān)心。

BT-474人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞產(chǎn)品信息

細(xì)胞名稱(chēng)：BT-474，人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞

細(xì)胞別稱(chēng)：Bt-474; BT474;人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞

種屬來(lái)源：人

年齡性別：女;60歲

組織來(lái)源：乳腺，乳房 ;乳腺導(dǎo)管癌

生長(zhǎng)特性：貼壁生長(zhǎng)

細(xì)胞形態(tài)：上皮細(xì)胞樣

STR位點(diǎn)信息：Amelogenin：X;CSF1PO：10，11;D13S317：11;D16S539：9，11;D18S51：13，18;D19S433：14，17;D21S11：28，32.2;D2S1338：19;D3S1358：17;D5S818：11，13;D7S820：9，12;D8S1179：10，12;FGA：22，25;TH01：7;TPOX：8;vWA：15，16;

保藏機(jī)構(gòu)：ATCC; CRL-7913 ATCC; HTB-20 BCRC; 60359 BCRJ; 0353 DSMZ; ACC-64 ;中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心

培養(yǎng)基：RPMI-1640+10%FBS+1%PS+10ug/ml牛胰島素(或重組人胰島素)

培養(yǎng)條件：氣相：95%空氣+5%二氧化碳;溫度：37℃

凍存條件：無(wú)血清凍存液，液氮儲(chǔ)存

倍增時(shí)間：84-100 hours

致瘤性：Yes, in Amsterdam/IMR rats with regression in 10 days. Yes, in nude mice.

BT-474人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞培養(yǎng)操作說(shuō)明

細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件

實(shí)驗(yàn)室條件

1. 無(wú)菌環(huán)境：無(wú)菌室包括更衣室，緩沖間，風(fēng)淋間，操作間

2. 儀器設(shè)備：超凈工作臺(tái)-操作平臺(tái)、CO2 培養(yǎng)箱-細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境、倒置顯微鏡-觀察細(xì)胞、離心機(jī)-離心收集細(xì)胞、冰箱-放置培養(yǎng)基等試劑、水浴鍋-復(fù)蘇細(xì)胞、真空泵-收集廢液、滅菌鍋-滅菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-凍存細(xì)胞、純水儀-制備一級(jí)水

3. 器材耗材：玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、巴士管、離心管、移液槍、槍頭(白色 0-10ul;黃色 20-200ul;藍(lán)色 100-1000ul)、濾器，吸管，多孔培養(yǎng)皿、6cm 皿、10cm 皿，培養(yǎng)瓶等。

4. 試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基、FBS胎牛血清、雙抗、牛胰島素(或重組人胰島素)、胰酶(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)、pbs

操作者工作范疇

1. 無(wú)菌操作：洗手，戴手套，穿實(shí)驗(yàn)服，常噴 75%酒精

BT-474人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞復(fù)蘇步驟

1.準(zhǔn)備：紫外線照臺(tái) 30min，提前打開(kāi)水浴鍋設(shè)置 37℃，培養(yǎng)基臨用前放水浴箱里溫育20 分鐘(或者放在超凈工作臺(tái)常溫放 30min)。在操作臺(tái)上擺放好物品，左邊放完全培養(yǎng)液，1mL 槍頭(已滅菌)，培養(yǎng)皿，右上角放廢液缸，1mL 移液槍?zhuān)?mL 巴氏管。檢查離心機(jī)，廢液泵。

2)待水浴鍋溫度達(dá)到 37℃時(shí)，戴上手套和護(hù)目鏡，從-196℃液氮罐中取出凍存管，將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，同時(shí)不斷輕輕搖動(dòng)凍存管，盡量保證凍存管內(nèi)細(xì)胞 1min 內(nèi)融化，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻， 移入離心機(jī)中 100rpm 離心 3min，以 75%酒精噴凍存管外部，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。

3)用 3mL 巴氏管取 5mL 新鮮培養(yǎng)基到一個(gè)新的 6cm 培養(yǎng)皿中，(若離心后細(xì)胞量較多，可取 12mL 新鮮培養(yǎng)基到一個(gè)新的 10cm 培養(yǎng)皿中)，標(biāo)記日期、所用培養(yǎng)基名稱(chēng)和細(xì)胞名稱(chēng)。

4)用廢液泵(吸力不要太大)取一個(gè)黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取 1mL 新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后(充分混勻)，將BT474細(xì)胞懸液加入到培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺(tái)上以畫(huà)“8”字法鋪勻細(xì)胞(一般培養(yǎng)皿在臺(tái)子上畫(huà) 30 個(gè) 8 字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測(cè)是否鋪勻細(xì)胞。

5)確定BT474細(xì)胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入 CO2 培養(yǎng)箱過(guò)夜。(盡量平直放入不要晃動(dòng))，第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

BT-474人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞傳代操作

從培養(yǎng)箱拿出BT-474細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)良好，且密度達(dá)到 85%左右的時(shí)候即可進(jìn)行傳代;

打開(kāi)廢液泵，用廢液泵吸頭(吸力不要太大)取一個(gè)藍(lán)色槍頭吸走上清廢液，用巴士管取 4ml 不含鈣、鎂離子的1xPBS(6cm 皿)到細(xì)胞培養(yǎng)皿中(若是 10cm 皿則取 8ml 1xPBS)，輕輕晃動(dòng)以清洗細(xì)胞表面1-2次;

用廢液泵吸走 PBS 廢液，加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)于培養(yǎng)瓶中，拿起培養(yǎng)皿輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)以便胰酶浸泡到每個(gè)細(xì)胞，消化 1-3min(根據(jù)細(xì)胞貼壁情況判斷，貼壁較牢的消化時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)或者放入 CO2 培養(yǎng)箱中消化幾分鐘)后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞是否變圓變亮，一旦發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大，即將脫離培養(yǎng)皿底，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

用 1ml 移液槍輕柔吹打，保證培養(yǎng)皿底的每個(gè)角落都吹打到，邊緣處也不能忽略(吹打時(shí)盡量避免產(chǎn)生氣泡，因其對(duì)細(xì)胞有傷害;需輕柔吹打，用力吹打?qū)?xì)胞也有傷害)，把培養(yǎng)瓶中所有細(xì)胞懸液用吸 1ml 移液槍移入無(wú)菌離心管中。

將裝有BT-474細(xì)胞懸液的離心管放入離心機(jī)中(配平)，1000 轉(zhuǎn)離心 3-5min，用廢液泵取一個(gè)黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取 1-2mL 新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后(充分混勻)，將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺(tái)上以畫(huà)“8”字法鋪勻細(xì)胞(一般培養(yǎng)皿在臺(tái)子上畫(huà) 30 個(gè) 8 字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測(cè)是否鋪勻細(xì)胞。

確定BT-474細(xì)胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入 CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(盡量平直放入不要晃動(dòng))。第二天再觀察細(xì)胞密度。

BT-474人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞凍存準(zhǔn)備

1) 準(zhǔn)備工作：紫外線照臺(tái) 30min，準(zhǔn)備好BT-474細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑物品：培養(yǎng)液，胰酶，PBS(試劑提前拿出 37℃預(yù)熱或者常溫放置半小時(shí)以上);傳代用培養(yǎng)皿，巴士管，離心管(已滅菌)，槍頭(已滅菌)，移液槍?zhuān)瑥U液缸。檢查離心機(jī)，廢液泵;

2)從培養(yǎng)箱拿出細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好且存活率高的狀態(tài)下，細(xì)胞密度達(dá) 80–90%時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存操作，以T25 瓶為例

bt474細(xì)胞凍存步驟

a.收集BT-474細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)所有培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管，裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b.根據(jù)BT-474細(xì)胞數(shù)量加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液， 在細(xì)胞凍存管上貼上細(xì)胞標(biāo)簽(細(xì)胞標(biāo)簽上包含：細(xì)胞名稱(chēng)、凍存日期、培養(yǎng)用的 培養(yǎng)基)。

c.將凍存管入庫(kù)到-80 度凍存盒里，放置 24 小時(shí)后，即可移入液氮中保存，標(biāo)記好入庫(kù)位置和凍存日期。

BT474細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)

bt474細(xì)胞呈島狀/片狀生長(zhǎng)：這是該細(xì)胞的特性，是正常現(xiàn)象，并不是細(xì)胞發(fā)生“聚團(tuán)”，無(wú)需擔(dān)心。細(xì)胞間連接緊密，在70%~80%密度時(shí)細(xì)胞實(shí)際數(shù)量其實(shí)比較大了，此時(shí)需要傳代。

bt474細(xì)胞生長(zhǎng)速度偏慢：注意控制傳代密度不要過(guò)低，否則生長(zhǎng)速度會(huì)極慢。推薦傳代比例1:2-1:4(具體情況視細(xì)胞生長(zhǎng)速度及密度決定)

黑點(diǎn)較多：bt474細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)背景中可能有黑點(diǎn)，為細(xì)胞代謝產(chǎn)物和細(xì)胞碎片，不影響細(xì)胞生長(zhǎng)。若黑點(diǎn)較多可以通過(guò)PBS潤(rùn)洗或換液清除。如果黑點(diǎn)較多同時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞變形、大量死亡或不生長(zhǎng)的情況，應(yīng)該考慮操作不當(dāng)導(dǎo)致細(xì)胞受損或者存在支原體污染。

存在漂浮細(xì)胞：bt474細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)存在部分漂浮的細(xì)胞是正常現(xiàn)象，不影響貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)。

BT-474人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)問(wèn)題

1.BT474人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞復(fù)蘇之后貼壁很慢正常嗎?

BT474細(xì)胞復(fù)蘇后需要一定時(shí)間恢復(fù)狀態(tài)，BT474細(xì)胞貼壁較慢，消化處理后48h內(nèi)盡量不要移動(dòng)，以免影響貼壁，生長(zhǎng)速度較慢，培養(yǎng)過(guò)程中，有小部分細(xì)胞會(huì)漂在培養(yǎng)基中屬于正常現(xiàn)象。

2.BT474傳代密度多大?

BT474細(xì)胞容易抱團(tuán)生長(zhǎng)，因此不會(huì)長(zhǎng)滿整個(gè)皿，細(xì)胞密度達(dá)70%以上即可傳代。

3.BT474細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中有很多小黑點(diǎn)是正常的嗎?

BT474細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)有碎片和分泌物是正常的。

4.BT474細(xì)胞一分二多久長(zhǎng)滿?

4天左右。

5.細(xì)胞呈島狀/片狀生長(zhǎng)正常嗎？

這是BT474細(xì)胞的特性，是正常現(xiàn)象，并不是細(xì)胞發(fā)生“聚團(tuán)”，無(wú)需擔(dān)心。細(xì)胞間連接緊密，在70%~80%密度時(shí)細(xì)胞實(shí)際數(shù)量其實(shí)比較大了，此時(shí)需要傳代。

6.BT474細(xì)胞生長(zhǎng)速度偏慢？

注意控制傳代密度不要過(guò)低，否則生長(zhǎng)速度會(huì)極慢。推薦傳代比例1:2-1:4(具體情況視細(xì)胞生長(zhǎng)速度及密度決定)

7.BT474細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)為什么會(huì)出現(xiàn)黑點(diǎn)較多的現(xiàn)象？

BT474細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)背景中可能有黑點(diǎn)，為細(xì)胞代謝產(chǎn)物和細(xì)胞碎片，不影響細(xì)胞生長(zhǎng)。若黑點(diǎn)較多可以通過(guò)PBS潤(rùn)洗或換液清除。如果黑點(diǎn)較多同時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞變形、大量死亡或不生長(zhǎng)的情況，應(yīng)該考慮操作不當(dāng)導(dǎo)致細(xì)胞受損或者存在支原體污染。

8.為什么會(huì)存在漂浮細(xì)胞？

Bt474細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)存在部分漂浮的細(xì)胞是正常現(xiàn)象，不影響貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)。

BT-474人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞應(yīng)用

1.PNRC多肽通過(guò)干擾核受體途徑抑制BT474細(xì)胞的增殖

目的

運(yùn)用核受體輔活化子PNRC的抗Ras PTD融合多肽(PTD-PARP)研究其在乳腺癌細(xì)胞BT474中的分布,對(duì)核受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑的影響及其抗腫瘤細(xì)胞增殖活性.

方法

用多肽合成儀合成PTD-PARP,單獨(dú)的PARP和PTD多肽以及FTFC標(biāo)記的PTD-PARP,PARP.HPLC分析和純化后,熒光顯微鏡結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)PTD-PARP,PARP在BT474細(xì)胞中的分布.蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)PTD-PARP對(duì)野生型PNRC輔活化ER反式激活功能的影響.MTS,軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PTD-PARP對(duì)BT474細(xì)胞的抗增殖活性.

結(jié)果

PTD-PARP能進(jìn)入BT474細(xì)胞,抑制野生型PNRC輔活化ER的反式激活功能并抑制BT474細(xì)胞的增殖.

結(jié)論

PNRC抗RasP DT融合多肽可通過(guò)干擾核受體途徑抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖.

2.用于藏藥毛訶子化學(xué)成分及體外抗癌活性的研究

總結(jié)了沒(méi)食子酸及其酚酸類(lèi)衍生物、鞣花酸及其酚酸類(lèi)衍生物、可水解鞣質(zhì)的質(zhì)譜解析規(guī)律。采用CellTiter-Blue?Cell Viability Assay法,對(duì)藏藥毛訶子不同極性萃取部位的抗癌活性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。

選用人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞(ZR 75-1)、人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞(BT-474)、人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)、人乳腺癌細(xì)胞(T-47D)、人結(jié)腸直腸腺癌細(xì)胞(Colo-205)、人結(jié)腸腺癌細(xì)胞(HT-29)、人結(jié)腸癌細(xì)胞(SW480)、人子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞(Hec-1-A)、人前列腺癌細(xì)胞(LnCap)和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)10種癌細(xì)胞為模型,比較藏藥毛訶子不同極性部位的抗癌活性,結(jié)果表明,藏藥毛訶子乙酸乙酯萃取部位和水萃取部位抗癌活性較強(qiáng),乙酸乙酯萃取部位對(duì)ZR 75-1、Colo-205、BT-474和T-47D癌細(xì)胞的抑制作用最為明顯,其半數(shù)抑制濃度IC50分別為27.33μg/mL、36.63μg/mL、5 0.67μg/mL和53.47μg/mL;

水萃取部位對(duì)T-47D和Colo-205癌細(xì)胞的抑制作用最為明顯,其半數(shù)抑制濃度IC50分別為35.98μg/mL和55.17μg/mL。

選用人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞(ZR75-1)和人結(jié)腸直腸腺癌細(xì)胞(Colo-205)為模型,對(duì)乙酸乙酯萃取部位分離得到的21個(gè)單體化合物進(jìn)行抗癌活性篩選,結(jié)果表明訶,子寧、訶子酸、安石榴苷、柯里拉京、五沒(méi)食子酰葡糖苷5個(gè)單體對(duì)ZR75-1癌細(xì)胞增殖有較強(qiáng)的抑制作用,且半數(shù)抑制濃度IC50分別為6.31 mM、7.48 mM、7.95mM、7.71 mM、25.23 mM;

訶子寧、訶子酸、安石榴苷、柯里拉京4個(gè)單體對(duì)Colo-205癌細(xì)胞增殖有較強(qiáng)的抑制作用,且半數(shù)抑制濃度IC50分別為6.04 mM、19.69mM、10.88 mM、7.58 mM。采用Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記法及流式細(xì)胞術(shù)研究檢測(cè)乙酸乙酯萃取部位對(duì)其較為敏感的人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞(ZR75-1)和人結(jié)腸直腸腺癌細(xì)胞(Colo-205)凋亡的影響,結(jié)果表明,毛訶子乙酸乙酯部位作用72 h對(duì)ZR75-1和Colo-205細(xì)胞具有顯著的誘導(dǎo)凋亡作用,且隨著藥物濃度的增加,細(xì)胞總凋亡率逐漸上升。

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The cells form adherent patches of epithelial-like cells The patches are compact multilayered colonies that rarely become confluent
 
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