Caco-2人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞簡介

Caco-2 人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞分離自一位72歲男性直腸原位癌，人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞系在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下匯合后，自發(fā)分化為腸上皮樣細(xì)胞，是常用的腸癌細(xì)胞模型。Caco-2細(xì)胞分離自直腸原位癌;當(dāng)長到滿時，Caco-2細(xì)胞表現(xiàn)出特征性的腸上皮細(xì)胞分化。Caco-2細(xì)胞表達(dá)維甲酸結(jié)合蛋白I和維甲酸結(jié)合蛋白Ⅱ，并呈角質(zhì)蛋白陽性。

Caco-2細(xì)胞模型是一種人克隆結(jié)腸腺癌細(xì)胞，結(jié)構(gòu)和功能類似于分化的小腸上皮細(xì)胞，具有微絨毛等結(jié)構(gòu)，并含有與小腸刷狀緣上皮相關(guān)的酶系，可以用來進行模擬體內(nèi)腸轉(zhuǎn)運的實驗。在細(xì)胞培養(yǎng)條件下，生長在多孔的可滲透聚碳酸酯膜上的細(xì)胞可融合并分化為腸上皮細(xì)胞，形成連續(xù)的單層，這與正常的成熟小腸上皮細(xì)胞在體外培育過程中出現(xiàn)反分化的情況不同。細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)研究表明，Caco-2細(xì)胞與人小腸上皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上相似，具有相同的細(xì)胞極性和緊密連接。胞飲功能的檢測也表明，Caco-2細(xì)胞與人小腸上皮細(xì)胞類似。

Caco-2人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞產(chǎn)品信息

細(xì)胞名稱：Caco-2，人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞

細(xì)胞別稱：CaCo-2; CACO-2; Caco 2; CACO 2; CACO2; CaCo2; CaCO2; Caco2; Caco-2/ATCC

種屬來源：人

性別年齡：男 72歲

組織來源：結(jié)腸

生長特性：貼壁生長

細(xì)胞形態(tài)：上皮細(xì)胞樣

染色體：85~90，91~100

倍增時間：~60-80 hours

致瘤性：Yes, in nude mice; forms moderately well differentiated adenocarcinoma consistent with colonic primary (grade II).

基因表達(dá)情況：keratin, retinoic acid binding protein 1, retinol binding protein 2

STR位點信息：Amelogenin：X；CSF1PO：11；D13S317：11，13，14；D16S539：12，13；D18S51：12；D19S433：15；D21S11：30，32；D2S1338：17，19.2，25；D3S1358：14，17；D5S818：12，13；D7S820：11，12；D8S1179：12，14；FGA：19；TH01：6；TPOX：9，11；vWA：16，18；

保藏機構(gòu)：ATCC; HTB-37 BCRJ; 0059 DSMZ; ACC-169 ECACC; 09042001 ECACC; 86010202

受體表達(dá)情況：This cell line expressed heat stable enterotoxin (Sta, E. coli) and epidermal growth factor (EGF).

Caco2細(xì)胞形態(tài) 

Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)操作說明

細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件

實驗室條件

1. 無菌環(huán)境：無菌室包括更衣室，緩沖間，風(fēng)淋間，操作間

2. 儀器設(shè)備：超凈工作臺-操作平臺、CO2 培養(yǎng)箱-細(xì)胞生長的環(huán)境、倒置顯微鏡-觀察細(xì)胞、離心機-離心收集細(xì)胞、冰箱-放置培養(yǎng)基等試劑、水浴鍋-復(fù)蘇細(xì)胞、真空泵-收集廢液、滅菌鍋-滅菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-凍存細(xì)胞、純水儀-制備一級水

3. 器材耗材：玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、巴士管、離心管、移液槍、槍頭(白色 0-10ul;黃色 20-200ul;藍(lán)色 100-1000ul)、濾器，吸管，多孔培養(yǎng)皿、6cm 皿、10cm 皿，培養(yǎng)瓶等。

4. 試劑：DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、FBS胎牛血清、雙抗、胰酶(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)、pbs

操作者工作范疇

1. 無菌操作：洗手，戴手套，穿實驗服，常噴75%酒精

Caco-2人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞培養(yǎng)操作步驟

Caco-2人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞復(fù)蘇步驟

1.準(zhǔn)備：紫外線照臺 30min，提前打開水浴鍋設(shè)置 37℃，培養(yǎng)基臨用前放水浴箱里溫育20 分鐘（或者放在超凈工作臺常溫放 30min）。在操作臺上擺放好物品，左邊放完全培養(yǎng)液，1mL 槍頭（已滅菌），培養(yǎng)皿，右上角放廢液缸，1mL 移液槍，3mL 巴氏管。檢查離心機，廢液泵。

2.待水浴鍋溫度達(dá)到 37℃時，戴上手套和護目鏡，從-196℃液氮罐中取出凍存管，將含有1 mLCaco-2人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，同時不斷輕輕搖動凍存管，盡量保證凍存管內(nèi)細(xì)胞 1min 內(nèi)融化，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻， 移入離心機中 100rpm 離心 3min，以 75%酒精噴凍存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。

3.用 3mL 巴氏管取 5mL 新鮮培養(yǎng)基到一個新的 6cm 培養(yǎng)皿中，（若離心后細(xì)胞量較多，可取 12mL 新鮮培養(yǎng)基到一個新的 10cm 培養(yǎng)皿中），標(biāo)記日期、所用培養(yǎng)基名稱和細(xì)胞名稱。

4.用廢液泵（吸力不要太大）取一個黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取 1mL 新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后（充分混勻），將細(xì)胞懸液加入到培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺上以畫“8”字法鋪勻Caco-2人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞（一般培養(yǎng)皿在臺子上畫 30 個 8 字即可鋪勻），最后在顯微鏡下檢測是否鋪勻細(xì)胞。

5.確定細(xì)胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入 CO2 培養(yǎng)箱過夜。（盡量平直放入不要晃動），第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

Caco-2人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞傳代操作

1. 準(zhǔn)備工作：紫外線照臺 30min，準(zhǔn)備好細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑物品：培養(yǎng)液，胰酶，PBS（試劑提前拿出 37℃預(yù)熱或者常溫放置半小時以上）；傳代用培養(yǎng)皿，巴士管，離心管（已滅菌），槍頭（已滅菌），移液槍，廢液缸。檢查離心機，廢液泵；

2.從培養(yǎng)箱拿出Caco-2人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)良好，且密度達(dá)到 85%左右的時候即可進行傳代；

3.打開廢液泵，用廢液泵吸頭（吸力不要太大）取一個藍(lán)色槍頭吸走上清廢液，用巴士管取 4ml 不含鈣、鎂離子的1xPBS（6cm 皿）到細(xì)胞培養(yǎng)皿中（若是 10cm 皿則取 8ml 1xPBS），輕輕晃動以清洗細(xì)胞表面1-2次；

4.用廢液泵吸走 PBS 廢液，加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.02% EDTA）于培養(yǎng)瓶中，拿起培養(yǎng)皿輕輕轉(zhuǎn)動以便胰酶浸泡到每個細(xì)胞，消化 1-3min（根據(jù)細(xì)胞貼壁情況判斷，貼壁較牢的消化時間長一點或者放入 CO2 培養(yǎng)箱中消化幾分鐘）后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞是否變圓變亮，一旦發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大，即將脫離培養(yǎng)皿底，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

5.用 1ml 移液槍輕柔吹打，保證培養(yǎng)皿底的每個角落都吹打到，邊緣處也不能忽略(吹打時盡量避免產(chǎn)生氣泡，因其對Caco-2人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞有傷害;需輕柔吹打，用力吹打?qū)?xì)胞也有傷害)，把培養(yǎng)瓶中所有細(xì)胞懸液用吸 1ml 移液槍移入無菌離心管中。

6.將裝有Caco-2人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞懸液的離心管放入離心機中（配平），1000 轉(zhuǎn)離心 3-5min，用廢液泵取一個黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取 1-2mL 新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后（充分混勻），將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺上以畫“8”字法鋪勻細(xì)胞（一般培養(yǎng)皿在臺子上畫 30 個 8 字即可鋪勻），最后在顯微鏡下檢測是否鋪勻細(xì)胞。

7.確定細(xì)胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入 CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。（盡量平直放入不要晃動）。第二天再觀察細(xì)胞密度。

Caco-2人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞凍存準(zhǔn)備

1) 準(zhǔn)備工作：紫外線照臺 30min，準(zhǔn)備好細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑物品：培養(yǎng)液，胰酶，PBS（試劑提前拿出 37℃預(yù)熱或者常溫放置半小時以上）；傳代用培養(yǎng)皿，巴士管，離心管（已滅菌），槍頭（已滅菌），移液槍，廢液缸。檢查離心機，廢液泵；

2)從培養(yǎng)箱拿出Caco-2人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞，在顯微鏡下觀察Hela細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞生長狀態(tài)良好且存活率高的狀態(tài)下，細(xì)胞密度達(dá) 80–90%時，可進行細(xì)胞凍存操作，以T25 瓶為例

Caco-2人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞凍存步驟

a.收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶內(nèi)所有培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無菌離心管，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細(xì)胞計數(shù)。

b.根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×10⁶~1×10⁷/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液， 在細(xì)胞凍存管上貼上細(xì)胞標(biāo)簽（細(xì)胞標(biāo)簽上包含：細(xì)胞名稱、凍存日期、培養(yǎng)用的 培養(yǎng)基）。

c.將凍存管入庫到-80 度凍存盒里，放置 24 小時后，即可移入液氮中保存，標(biāo)記好入庫位置和凍存日期。

Caco-2人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞培養(yǎng)常見問題

1.Caco-2人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞有空泡是正常的嗎?

Caco-2細(xì)胞群中常常含有巨大的空泡，這是細(xì)胞本身的特性，屬于正常現(xiàn)象。

Caco-2有少量發(fā)亮的細(xì)胞漂浮或黏附在細(xì)胞克隆上，是正常的，隨后會進入克隆并正常生長。所以避免頻繁觀察細(xì)胞，可以減少漂浮細(xì)胞產(chǎn)生。如果細(xì)胞隨著培養(yǎng)過程，漂浮得越來越嚴(yán)重，甚至大塊兒飄起，就要檢查培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)環(huán)境是否出現(xiàn)異常。細(xì)胞密度越高，消化時間越長。

血清質(zhì)量差異可能引起細(xì)胞狀態(tài)變化，建議選用高質(zhì)量的胎牛血清。

2.Caco-2人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞消化時間多久?

Caco-2細(xì)胞與細(xì)胞間連接緊密，細(xì)胞難以消化解離。生長時間越長，細(xì)胞間連接越緊密，消化時間越長。消化時間為5-10分鐘，該細(xì)胞難以被吹散為單個細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞能夠被吹散為小的細(xì)胞團塊，即可終止消化。

如果消化5-10分鐘，細(xì)胞部分脫落，另一部分仍然貼壁緊密，可以將脫落細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管，向原瓶中加入新的胰酶，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)消化剩余細(xì)胞，每隔1min拿出來觀察，直到細(xì)胞滑落。

3.Caco-2人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞傳代多久長滿?

Caco-2傳代周期較長，倍增時間約為72h。Caco-2貼壁和生長都較為緩慢。80%密度1:2傳代的前提下，Caco-2通常需要培養(yǎng)5-7天再傳代。

4.Caco-2人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞復(fù)蘇不貼壁?

Caco-2人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞貼壁較慢，在復(fù)蘇或傳代初期，若有許多細(xì)胞或細(xì)胞碎片漂浮為正?，F(xiàn)象，為避免在細(xì)胞附著初期干擾細(xì)胞，建議到第三天才換液。待細(xì)胞貼壁后，一周即可長滿(1:3傳代)，若細(xì)胞生長過慢，可適當(dāng)調(diào)整血清濃度到20%。

Caco-2培養(yǎng)基里添加的胎牛血清比例為10%，當(dāng)血清比例降低，貼壁性下降時，補充胎牛血清至20%，繼續(xù)培養(yǎng)1-2天，細(xì)胞即可貼壁。檢查培養(yǎng)基是否偏堿(呈紫紅色)，偏堿的培養(yǎng)基可能導(dǎo)致細(xì)胞無法貼壁。

5.Caco-2人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞漂浮細(xì)胞多怎么辦?

有少量發(fā)亮的細(xì)胞漂浮或黏附在細(xì)胞克隆上，是正常的，隨后會進入克隆并正常生長。所以避免頻繁觀察細(xì)胞，可以減少漂浮細(xì)胞產(chǎn)生。如果Caco-2細(xì)胞隨著培養(yǎng)過程，漂浮得越來越嚴(yán)重，甚至大塊兒飄起，就要檢查培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)環(huán)境是否出現(xiàn)異常了。

Caco-2人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞培養(yǎng)注意事項

a.Caco-2細(xì)胞貼壁慢特別是剛復(fù)蘇時，一般2-3天貼壁展開，會有空泡。

b.Caco-2細(xì)胞在傳代細(xì)胞中，注意消化散，否則難以貼壁。

c.成團生長，細(xì)胞密度越大，表面空泡黑點越多。

d.一般Caco-2細(xì)胞長至80%傳代，細(xì)胞成片，其實密度很大。

e.Caco-2細(xì)胞生長太滿對細(xì)胞狀態(tài)影響嚴(yán)重，傳代后易碎，死亡。

f.Caco-2細(xì)胞生長時間越長，消化時間越長。

Caco-2細(xì)胞文獻(xiàn)溯源

1979年始，迄今為止，關(guān)于人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞的文獻(xiàn)已有7030篇。

在pubmed數(shù)據(jù)庫中用“Caco-2 cell line”搜索該關(guān)鍵詞，第一篇為1979年M Rousset在Cancer Res.發(fā)表的“Presence and cell growth-related variations of glycogen in human colorectal adenocarcinoma cell lines in culture”。

文獻(xiàn)概述

研究了四株人類結(jié)直腸腺癌細(xì)胞系(HT-29、HRT-18、SW-480和Caco-2)的異步和同步培養(yǎng)中，細(xì)胞內(nèi)糖原水平的存在和動力學(xué)。

結(jié)果表明，在所研究的細(xì)胞系的細(xì)胞生長過程中，存在一種特定的糖原積累模式。

在異步培養(yǎng)中，糖原積累的動力學(xué)在不同的細(xì)胞系之間是相似的，其特點是在指數(shù)生長期糖原含量較低，而在平穩(wěn)期則增加了3至4倍。而每個細(xì)胞系在這兩個生長期中的糖原量是特定的。

在Caco-2、HRT-18、HT-29和SW-480細(xì)胞中找到的最大糖原值分別為258.5 +/- 6.9(S.D.)、88.9 +/- 2.6、87.5 +/- 3和17.5 +/- 1.8微克糖原/毫克蛋白質(zhì)。

還研究了HT-29和HRT-18細(xì)胞系的同步培養(yǎng)中糖原積累的細(xì)胞周期動力學(xué)。這兩個細(xì)胞系在S、G2和M期間表現(xiàn)出糖原含量較低的共同模式，并在G1期開始后增加(達(dá)到初始值的2.5到3倍)，在此階段的中期達(dá)到峰值。隨后在G1的后半部分有對稱性的減少。

總結(jié)：該研究通過異步和同步培養(yǎng)的方法，揭示了人類結(jié)直腸腺癌細(xì)胞在細(xì)胞生長過程中糖原的動態(tài)變化。異步培養(yǎng)中不同細(xì)胞系的糖原積累模式相似，而同步培養(yǎng)中的兩個細(xì)胞系表現(xiàn)出一致的糖原含量變化模式。

Caco-2細(xì)胞應(yīng)用領(lǐng)域

Caco2細(xì)胞廣泛用于研究藥物在腸道的吸收和轉(zhuǎn)運過程。由于Caco2細(xì)胞具有腸上皮細(xì)胞的特點，因此可以模擬藥物穿過腸道黏膜的生理過程?？蒲腥藛T可以在Caco2細(xì)胞培養(yǎng)基中添加不同濃度的藥物，觀察其在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運和吸收情況，從而評估藥物在體內(nèi)的藥代動力學(xué)。

此外，Caco2細(xì)胞還可以用于研究腸道疾病的發(fā)病機制，如炎癥性腸病和腸道感染等。通過模擬疾病條件，科研人員可以觀察Caco2細(xì)胞的相應(yīng)反應(yīng)，探究疾病的發(fā)展過程。

Caco-2細(xì)胞系最初來源于結(jié)腸癌。然而，其最有益的特性之一是其能夠自發(fā)分化為具有許多與小腸吸收細(xì)胞相似的單層細(xì)胞，具有刷狀邊緣層。Caco-2細(xì)胞系異質(zhì)性，包含具有稍許不同性質(zhì)的細(xì)胞。

在代謝特征研究方面，學(xué)者利用Caco-2細(xì)胞研究其代謝產(chǎn)生的化合物，使用HPLC等技術(shù)進行含量測定;學(xué)者還可以利用Caco-2細(xì)胞探究該細(xì)胞的體外消化與代謝組學(xué)特征，如該細(xì)胞對利奈唑胺等藥物的代謝特征，括了化合物的滲透性、轉(zhuǎn)運過程、代謝酶的活性等方面。推斷出藥物在體內(nèi)的代謝過程，并指導(dǎo)臨床用藥的調(diào)整和優(yōu)化。

學(xué)者利用Caco-2細(xì)胞研究結(jié)腸癌細(xì)胞特征，包括細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞調(diào)亡。以及藥物如去甲烏藥堿和姜黃素對結(jié)腸癌細(xì)胞的吸收和轉(zhuǎn)運。同時，Caco-2細(xì)胞還可以用來研究化合物如槲皮素、姜黃素的跨膜轉(zhuǎn)運機制，使用分子對接等技術(shù)預(yù)測其轉(zhuǎn)運特性。

研究人員利用Caco-2細(xì)胞研究其如何應(yīng)對氧化應(yīng)激以及細(xì)胞凋亡，包括產(chǎn)生抗氧化酶和應(yīng)對脂多糖(LPS)等誘導(dǎo)的氧化壓力，并使用高效液相色譜法(HPLC)等手段來檢測細(xì)胞調(diào)亡相關(guān)的生化標(biāo)記。

Caco-2細(xì)胞研究進展

近年來，隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和細(xì)胞生物學(xué)研究的發(fā)展，Caco2細(xì)胞在藥物研發(fā)、腸道疾病研究等領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用。研究人員通過基因編輯技術(shù)和高通量篩選技術(shù)，不斷提高Caco2細(xì)胞的模擬能力和研究效率。一些研究還表明，Caco2細(xì)胞可以應(yīng)用于藥物腸道黏膜遞送系統(tǒng)、腸-肝循環(huán)等方面。

Caco-2細(xì)胞結(jié)論

Caco2細(xì)胞作為一種常用的結(jié)腸腺癌細(xì)胞系，具有模擬腸道黏膜和疾病發(fā)生機制的能力。在藥物研發(fā)和腸道疾病研究中，Caco2細(xì)胞的應(yīng)用將繼續(xù)發(fā)揮重要作用。未來，隨著細(xì)胞生物學(xué)和疾病模型的不斷改進，Caco2細(xì)胞的研究前景仍然廣闊。

Caco-2細(xì)胞標(biāo)志物

1. 緊密連接蛋白：Claudins、Occludin

2. 跨膜糖蛋白：EpCAM

3. 黏附分子：Integrins

4. 鈉依賴性葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白：SGLT1