體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長增殖能力的判定，不僅代表了細(xì)胞的基本屬性，也是進(jìn)行藥物檢測、轉(zhuǎn)化檢測、培養(yǎng)基篩選等許多方面的重要監(jiān)測指標(biāo)。判定細(xì)胞增殖能力的指標(biāo)主要是生長曲線、分裂指數(shù)、克隆形成率及細(xì)胞活力等測定。

細(xì)胞生長狀況有關(guān)指標(biāo)的檢測方法

一、細(xì)胞計(jì)數(shù)

這是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的基本技術(shù)之一。所用材料為血球計(jì)數(shù)板，巴氏吸管和顯微鏡。

細(xì)胞計(jì)數(shù)的基本步驟

(1)取清潔計(jì)數(shù)板和專用蓋玻片，用絲綢布輕輕拭干。

(2)取細(xì)胞懸液0.3mL，加入0.9mL結(jié)晶紫(或臺(tái)盼至)染液，混勻后滴半滴于血球計(jì)數(shù)板內(nèi)，以充滿不外溢為宜。也可直接將細(xì)胞懸液在一側(cè)滴加到蓋玻片中，不要溢出，也不要過少或出現(xiàn)氣泡.

(3)在顯微鏡下用10×物鏡觀察計(jì)數(shù)四角大分格中的細(xì)胞數(shù)。代入下式得出細(xì)胞密度。細(xì)胞數(shù)/ml=(4大格細(xì)胞數(shù)之和/4)×104×稀釋倍數(shù)臺(tái)盼藍(lán)染色法可計(jì)算出活細(xì)胞數(shù)和死細(xì)胞數(shù)以測定細(xì)胞存活百分率。一般0.5%～1%的臺(tái)盼藍(lán)染液可使死細(xì)胞染成藍(lán)色，活細(xì)胞不著色。此外還可用0.02%的藻紅B染液將死細(xì)胞或受損細(xì)胞染成紅色，或用0.05%的苯胺黑染液將死細(xì)胞染成黑色。細(xì)胞存活百分率=(4大格活細(xì)胞數(shù)/4大格活細(xì)胞+死細(xì)胞數(shù))×100%細(xì)胞計(jì)數(shù)除用上述方法外，目前還有新型的自動(dòng)計(jì)數(shù)儀，可供大規(guī)模細(xì)胞計(jì)數(shù)工作使用。各種型號的計(jì)數(shù)操作不盡相同，可根據(jù)使用說明進(jìn)行操作。在進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)操作時(shí)，必須把細(xì)胞懸液準(zhǔn)備好，細(xì)胞應(yīng)分散良好，并充分混勻，若出現(xiàn)較多細(xì)胞團(tuán)或細(xì)胞數(shù)少于200個(gè)/10mm2或多于500個(gè)/10mm2時(shí)，需重制細(xì)胞懸液，重新計(jì)數(shù)。

二、細(xì)胞生長曲線和生長倍數(shù)

生長曲線是培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一，是測定細(xì)胞絕對生長數(shù)的常用方法，也是判定細(xì)胞活力的重要指標(biāo)。

常用于測定藥物等外來因素對細(xì)胞生長的影響!

細(xì)胞生長曲線是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中最基本的指標(biāo)，是測定細(xì)胞絕對增長數(shù)值和生長繁殖基本規(guī)律常用的簡便方法。

常用的方法為

在同一規(guī)格的培養(yǎng)瓶中，接種同等量的同一代細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后每隔24小時(shí)取出幾瓶細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫座標(biāo)，不同時(shí)刻的細(xì)胞數(shù)的對數(shù)為底座標(biāo)，標(biāo)出各點(diǎn)并連成線，即為該細(xì)胞的生長曲線，可反應(yīng)出細(xì)胞生長的動(dòng)態(tài)。測定生長曲線的另一種方法是用96孔/24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分7組，每組3孔，培養(yǎng)一周(7天)，期間逐日檢測一組，計(jì)數(shù)，最后把7天中的細(xì)胞數(shù)值繪成圖，即為細(xì)胞生長曲線。也可采用MTT法來進(jìn)行生長曲線測定，較上述方法簡便。標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞生長曲線近似“S”形，一般在傳代后第一天細(xì)胞數(shù)有所減少，經(jīng)過一段時(shí)間的潛伏期，再進(jìn)入對數(shù)生長期，達(dá)到平臺(tái)期和生長穩(wěn)定，最后衰老。細(xì)胞生長倍數(shù)是指測定接種時(shí)活細(xì)胞的濃度，經(jīng)一個(gè)生長周期達(dá)到最大活細(xì)胞濃度的比率。生長倍數(shù)=培養(yǎng)后最大活細(xì)胞濃度/接種時(shí)的活細(xì)胞濃度。

三、細(xì)胞分裂指數(shù)細(xì)胞分裂指數(shù)

細(xì)胞分裂指數(shù)細(xì)胞分裂指數(shù)是表示細(xì)胞增殖旺盛程度的指標(biāo)。它以被測1000個(gè)細(xì)胞中的分裂細(xì)胞數(shù)來計(jì)算。其方法為：用秋水仙素將細(xì)胞處理1～2小時(shí)后，按染色體制片法制片并染色，計(jì)算1000個(gè)細(xì)胞中分裂相的數(shù)目，重復(fù)4次取平均值，用百分比表示。

基本步驟

(1)細(xì)胞準(zhǔn)備用蓋片(支持物)培養(yǎng)法。

(2)每24小時(shí)取出一個(gè)小玻片，按常規(guī)方法進(jìn)行固定，吉姆薩或HE染色，封片，制成永久標(biāo)本。

(3)顯微鏡下選擇細(xì)胞密度適中的區(qū)域觀察分裂細(xì)胞并計(jì)數(shù)。逐個(gè)視野進(jìn)行，對每一時(shí)間組的玻片各取細(xì)胞多、中、少3個(gè)區(qū)域各一區(qū)，共數(shù)1000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算出平均分裂相值所占百分比。觀察時(shí)要掌握好分裂相標(biāo)準(zhǔn)，主要是確定好劃分間期和前期，末期和間期等的界限，以減少誤差。

細(xì)胞分裂指數(shù)=細(xì)胞分裂相數(shù)/細(xì)胞總數(shù)(1000)×1000

四、細(xì)胞接種存活率

細(xì)胞接種存活率又稱細(xì)胞貼壁率。它是細(xì)胞被制成分散的懸液后，以低密度(2～5個(gè)細(xì)胞/cm2)被接種到底物上，貼壁并能存活生長形成細(xì)胞小群(克隆)的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)值，用以表示細(xì)胞的生存能力和細(xì)胞群的活力。

基本步驟

(1)取對生長期細(xì)胞，用消化法制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后按檢測細(xì)胞生長曲線的接種細(xì)胞的原則，將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶(濃度相對高些)。接種12～15瓶。

(2)每2小時(shí)取出一瓶細(xì)胞，倒掉培養(yǎng)液，然后加入胰酶消化已貼壁細(xì)胞，計(jì)數(shù)已貼壁細(xì)胞，用下面公式逐個(gè)計(jì)算每個(gè)時(shí)間上的貼壁率。每2小時(shí)一次，共觀察24小時(shí)即12。

接種存活率%(貼壁率)=(貼壁存活細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%

五、克隆形成率

細(xì)胞接種存活率只表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞數(shù)，但貼壁后的細(xì)胞不一定每個(gè)都能增殖和形成克隆。而形成克隆的細(xì)胞必為貼壁和有增殖活力的細(xì)胞?？寺⌒纬陕史从臣?xì)胞群體依賴性和增殖能力兩個(gè)重要性狀。由于細(xì)胞生物學(xué)性狀不同，細(xì)胞克隆形成率差別也很大，一般初代培養(yǎng)細(xì)胞克隆形成率弱，傳代細(xì)胞系強(qiáng);二倍體細(xì)胞克隆形成率弱，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系強(qiáng);正常細(xì)胞克隆形成率弱，腫瘤細(xì)胞強(qiáng)。并且克隆形成率與接種密度有一定關(guān)系，做克隆形成率測定時(shí)，接種細(xì)胞一定要分散成單細(xì)胞懸液，直接接種在碟皿中，持續(xù)一周，隨時(shí)檢查，到細(xì)胞形成克隆時(shí)終止培養(yǎng)。

1.平板克隆形成試驗(yàn)基本步驟

(1)取對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，把細(xì)胞懸浮在10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中備用。

(2)將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，以適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度(根據(jù)增殖能力)接種于培養(yǎng)皿中。一般分每皿50、100、200個(gè)細(xì)胞的梯度密度分別接種含10mL 37℃預(yù)溫培養(yǎng)液的皿中，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，使細(xì)胞分散均勻。置37℃ 5% CO2及飽和濕度的環(huán)境下，靜置培養(yǎng)2～3周。

(3)經(jīng)常觀察，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加純甲醇或1：3醋酸/甲醇5mL，固定15分鐘。然后去固定液，加適量Giemsa應(yīng)用染色液染10～30分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。

(4)將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計(jì)數(shù)克隆，或在顯微鏡(低倍鏡)計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。最后計(jì)算克隆形成率。

克隆形成率= 克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%

接種細(xì)胞數(shù)平板克隆形成試驗(yàn)方法簡單，適用于貼壁生長的細(xì)胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗(yàn)成功的關(guān)鍵是細(xì)胞懸液的制備和接種密度。細(xì)胞一定要分散得好，不能有細(xì)胞團(tuán)，接種密度不能過大。

2.軟瓊脂培養(yǎng)克隆形成試驗(yàn)基本步驟

(1)取對數(shù)生長期細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細(xì)胞，作活細(xì)胞計(jì)數(shù)，用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至1×106細(xì)胞/L。然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求作梯度倍數(shù)稀釋。

(2)用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個(gè)濃度的低溶點(diǎn)瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40℃中不會(huì)凝固。

(3)按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直徑6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷卻凝固，可作底層瓊脂置CO2溫箱中備用。

(4)按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基在無菌試管中相混以后，再向管中加入0.2mL的細(xì)胞懸液，充分混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37℃ 5%CO2溫箱中培養(yǎng)10～14天。

(5)把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細(xì)胞克隆數(shù)。計(jì)算形成率。軟瓊脂培養(yǎng)法常用檢測腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。試驗(yàn)中瓊脂與細(xì)胞相混時(shí)，瓊脂溫度不宜超過40℃。接種細(xì)胞的密度每平方厘米不超過35個(gè)，一般6cm的平皿接種1000個(gè)細(xì)胞。正常細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下不能增殖，不適用于軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)。

六、細(xì)胞周期

標(biāo)記有絲分裂百分率法(percentage labeledmitoses，PLM)

對測定細(xì)胞進(jìn)行脈沖標(biāo)記、定時(shí)取材、利用放射自顯影技術(shù)顯示標(biāo)記細(xì)胞，通過統(tǒng)計(jì)標(biāo)記有絲分裂細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的辦法來測定細(xì)胞周期。放射標(biāo)記物為3H或者14C標(biāo)記的TdR。

七、MTT法測定細(xì)胞活力

四唑鹽(MTT)商品名為噻唑藍(lán)，四唑鹽比色法的原理：活細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物甲躦(formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這種功能。二甲亞砜(DMSO)能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標(biāo)儀測定OD值。

MTT法簡單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等。

操作步驟

(1) 細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板; 103-104細(xì)胞/孔，每孔培養(yǎng)基總量200微升(96孔培養(yǎng)板每孔容積370微升)，37°C、5%CO2培

養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時(shí)間(根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時(shí)間)。

(2)加入2毫克/毫升的MTT液(50微升/孔);繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。

(3)吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液(150微升/孔)，將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘，使結(jié)晶物溶解。

(4)酶標(biāo)儀檢測各孔OD值(檢測波長570納米)。記錄結(jié)果，繪制細(xì)胞生長曲線。

每隔24小時(shí)測量一個(gè)點(diǎn)，3個(gè)平行樣品。