huvec細(xì)胞血管形成實(shí)驗(yàn)背景簡(jiǎn)介

HUVEC 是從臍帶靜脈內(nèi)壁分離出來(lái)的原代細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞常用于研究低氧、炎癥、氧化應(yīng)激、感染反應(yīng)及正常和腫瘤相關(guān)血管生成等應(yīng)用。

血管生成(Angiogenesis)是從已有的毛細(xì)血管或毛細(xì)血管后靜脈發(fā)展而形成新的血管，其對(duì)于器官生長(zhǎng)、胚胎發(fā)育和傷口愈合在內(nèi)的多種過程十分重要。多種類型的內(nèi)皮細(xì)胞均可用于本實(shí)驗(yàn)，包括原代細(xì)胞和永生化細(xì)胞系。常用的有人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，之所以不采用靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞與動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞是因?yàn)镠UVEC具有干細(xì)胞的潛能，理論上可以傳代50-60次。

HUVEC細(xì)胞形態(tài)

HUVEC細(xì)胞特點(diǎn)

① 來(lái)源方便

HUVEC來(lái)源于新生兒的臍帶組織，容易獲取，沒有倫理爭(zhēng)議，且便于提取足量細(xì)胞。從人臍靜脈細(xì)小的血管組織中分離出內(nèi)皮細(xì)胞，原代提取及培養(yǎng)工作量大。

② 具有細(xì)胞成管的能力

此為內(nèi)皮細(xì)胞最基本的特征。

③ 原代HUVEC最接近人自體內(nèi)皮細(xì)胞，體現(xiàn)新生血管內(nèi)皮的特點(diǎn)。

材料準(zhǔn)備

ECM內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基，DMEM培養(yǎng)基，基質(zhì)膠，胰酶，PBS磷酸緩沖液

操作步驟

A.準(zhǔn)備基質(zhì)膠

1. 實(shí)驗(yàn)前一天將基質(zhì)膠置于冰盒中，放入 4℃冰箱，使膠能過夜緩慢融化。(注意：同樣要準(zhǔn)備一些4℃預(yù)冷的槍頭用于吸取基質(zhì)膠)

2. 開始實(shí)驗(yàn)前，將基質(zhì)膠始終保持放在冰盒中。

3. 冰上操作?；|(zhì)膠用預(yù)冷槍頭混勻。

B.鋪基質(zhì)膠

由于每一批基質(zhì)膠濃度會(huì)有差異，建議使用前做1:1及2:1的稀釋，操作如下：

提前將96孔板和槍頭預(yù)冷，準(zhǔn)備兩個(gè)預(yù)冷1.5 mL離心管用于稀釋基質(zhì)膠。按照想要的比例，稀釋完基質(zhì)膠后，于每孔中加入50 μL 基質(zhì)膠，避免產(chǎn)生氣泡。在37℃培養(yǎng)箱中放置45 min-1 h。(注意槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方加入基質(zhì)膠，防止有基質(zhì)膠流經(jīng)孔壁而留下殘留膠。若是孔的底部沒有鋪滿膠，可以晃動(dòng)一下96孔板，使底部鋪膠均勻)例如：鋪原膠、稀釋1倍、稀釋0.5倍時(shí)，用DMEM稀釋。

C.鋪細(xì)胞

1.當(dāng)HUVEC細(xì)胞長(zhǎng)滿70~80%時(shí)，消化下來(lái)，并用含10%FBS的DMEM 重懸，計(jì)數(shù)，使每孔加入50μL重懸液，濃度為30000個(gè)細(xì)胞/孔，重復(fù)三孔。(注意保持槍頭垂直在孔的上方，不要接觸到下面的凝膠。)

2.37℃培養(yǎng)箱孵育，四小時(shí)后可見血管形成。

HUVEC細(xì)胞血管實(shí)驗(yàn)常見問題

1.稀釋基質(zhì)膠用什么稀釋?

用不加雙抗、不加胎牛血清的高糖的DMEM培養(yǎng)基稀釋。

2.怎么樣鋪膠均勻?

槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方加入基質(zhì)膠，防止有基質(zhì)膠流經(jīng)孔壁而留下殘留膠。若是孔的底部沒有鋪滿膠，可以晃動(dòng)一下96孔板，使底部鋪膠均勻，若還是沒有均勻，可用槍頭稍微攪動(dòng)一下。

3.進(jìn)行血管形成實(shí)驗(yàn)，應(yīng)該選用多大濃度的基質(zhì)膠呢?

最低濃度應(yīng)不低于10mg/mL， 基質(zhì)膠的稀釋比例是6 mg/mL以上。成管效果最好的是6-8 mg/mL

HUVEC細(xì)胞標(biāo)志物熒光鑒定

HUVEC細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)