HUVEC人臍靜脈內皮細胞永生化細胞背景簡介

1984年，HUVEC細胞株由Hiroyoshi Hoshi、Wallace L.Mckeehan從一段長約10-20cm的人正常臍帶靜脈中獲取、建立。

SetsukoShioda等人研究發(fā)現(xiàn)，HUVEC細胞株18-30代的倍增時間為23.5個小時，24-27代的倍增時間為67個小時，27-30代的倍增時間為84個小時，32-34代的倍增時間為100個小時。培養(yǎng)至40代后，細胞形態(tài)出現(xiàn)多樣化，有些細胞變大或變小，有些細胞出現(xiàn)多核;細胞密度下降、倍增時間延長。最后細胞在第54代停止生長，ATCC的預期壽命也顯示在50-60代。

2018年，Setsuko Shioda等人發(fā)現(xiàn)HUVEC細胞株(passage 31)在貼壁匯合時細胞與細胞之間存在間隙，這與典型的內皮細胞特征有所不同。

HUVEC人臍靜脈內皮細胞永生化培養(yǎng)說明書下載

HUVEC細胞形態(tài)圖

HUVECC ATCC細胞形態(tài)圖

huvecs細胞的培養(yǎng)方法

huvecs細胞培養(yǎng)實驗準備

提前開啟紫外照射30min消毒滅菌，工作臺開燈通風10min，用75%酒精擦拭臺面。

器材耗材：玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、巴士管、離心管、移液槍、槍頭(白色0-10ul;黃色20-200ul;藍色100-1000ul)、濾器、吸管、多孔培養(yǎng)皿、6cm皿、10cm皿，培養(yǎng)瓶等。

試劑：ECM完全培養(yǎng)基、PBS、消化液、凍存液。

HUVEC細胞復蘇操作

1.將含有1 mL HUVEC細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。

2.在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。

3.將所有HUVEC人臍靜脈內皮細胞(永生化)懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜(或將細胞懸液加入6 cm皿中，加入約4 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜)。

4.第二天換液并檢查HUVEC人臍靜脈內皮細胞密度。

HUVEC細胞傳代步驟

HUVEC細胞培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基：內皮細胞培養(yǎng)基礎培養(yǎng)基+5% FBS+1%內皮細胞培養(yǎng)添加劑+1% P/S

推薦傳代比例：1:2至1:3

推薦換液頻率：每2-3天換液一次

倍增時間：~23.5 hours

消化時間：常溫消化2-3分鐘

培養(yǎng)條件：氣相：95%空氣+5%CO?，溫度：37℃

HUVEC細胞傳代方法

如果HUVEC細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗HUVEC細胞1-2次。

b、加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.02%EDTA)于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有HUVEC人臍靜脈內皮細胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-3 min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若HUVEC細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將HUVEC細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

備注：收到HUVEC細胞后第一次傳代建議1：2傳代

HUVEC細胞凍存步驟

凍存條件

凍存液：無血清凍存液，液氮儲存

(即用型、無血清、無需程序降溫)

細胞凍存密度：5×10^6~1×10^7/mL

HUVEC細胞凍存方法

待HUVEC細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面 T25 瓶為例

1.收集HUVEC人臍靜脈內皮細胞，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，然后進行細胞計數(shù)。

2.根據細胞數(shù)量對應加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×10^6~1×10^7/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。

3.將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

注意: 細胞不可長期保存在-80℃冰箱中。建議24 h后盡快轉移至液氮中。

HUVEC細胞培養(yǎng)要點

1.HUVEC細胞培養(yǎng)難度較高，建議使用內皮細胞專用培養(yǎng)基。

2.建議細胞前三次傳代中凍存部分細胞，后續(xù)遇到問題可重新復蘇。

3.部分細胞傳代后細胞內出現(xiàn)黑色小點，細胞間隙內出現(xiàn)少量顆粒物或者培養(yǎng)基中浮游著少量死細胞等均為正?，F(xiàn)象，對細胞的增殖及試驗無影響。

4.細胞外的黑色顆粒大部分是細胞碎片，可以吸去細胞懸液后用PBS進行清洗;如若PBS清洗后未能清除的碎片，可以用胰酶消化細胞重新接種，如果碎片較多，建議用PBS多清洗幾遍。

5.細胞傳代處理后的第二天，在顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，如死細胞較多且細胞密度較低，需要進行換液操作，也可視情況穩(wěn)定。

6.注意此細胞為SV40病毒轉染構建的永生化細胞，細胞需要使用ECM專用的培養(yǎng)基。

7.HUVEC細胞培養(yǎng)過程中，需要每兩天棄掉舊的培養(yǎng)基清洗并更換新的培養(yǎng)基，換液頻率要維持較高水平，以保證細胞的正常擴增。

HUVEC細胞培養(yǎng)常見問題

HUVEC細胞必須用專用培養(yǎng)基嗎？

HUVEC細胞用普通培養(yǎng)基的話，還要添加生長因子，常見的有ECGF/ECGF，ECGF，但價格貴，不如專用培養(yǎng)基來的劃算，故推薦使用專用培養(yǎng)基。

HUVEC細胞系換液第二天出現(xiàn)空泡化？

可能原因

1. 是培養(yǎng)液的pH值與細胞正常所需pH值差別太大，導致細胞代謝異常，出現(xiàn)空泡化;

2. 是在細胞培養(yǎng)過程中，由于血清濃度不夠、藥物作用、外界刺激等情況下導致細胞代謝出現(xiàn)問題，內質網應激狀況下會出現(xiàn)細胞空泡化的情況。

解決細胞空泡化方法

1. 測定完培的pH，看其酸堿性是否適宜。多數(shù)細胞適宜的pH范圍為7.2-7.4。

2. 若培基或血清是開封存放很久的，可換用新鮮的完全培養(yǎng)基給細胞換液；若都是新開封的，可換用新批次的基培或血配制培養(yǎng)液，給細胞換液觀察。

HUVEC培養(yǎng)過程中出現(xiàn)聚團如何處理？

原因分析

可能由于培養(yǎng)板親水性差或者血清中的促貼壁因子不足。

解決辦法

1.培養(yǎng)瓶使用前一天使用明膠包被。

包被方法：以T25瓶為例，取用5ml明膠放入T25瓶，放置37℃下30分鐘以上，后將多余明膠吸出。

2.提高培養(yǎng)液中基質膠濃度。

3.培養(yǎng)基使用ECM內皮專用培養(yǎng)基進行配置。