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大鼠軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定方法視頻教程

發(fā)布時(shí)間:2024-08-05 11:50:05 細(xì)胞資源庫(kù)平臺(tái) 訪問(wèn)量:185

大鼠軟骨細(xì)胞簡(jiǎn)介

大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分離自關(guān)節(jié)軟骨組織;關(guān)節(jié)軟骨屬于透明軟骨,表面光滑、呈淡藍(lán)色、有光澤,它是由一種特殊的叫做致密結(jié)締組織的膠原纖維構(gòu)成的基本框架,這種框架呈半環(huán)形,類(lèi)似拱形球門(mén),其底端緊緊附著在下面的骨質(zhì)上,上端朝向關(guān)節(jié)面,這種結(jié)構(gòu)使關(guān)節(jié)軟骨緊緊與骨結(jié)合起來(lái)而不會(huì)掉下來(lái),同時(shí)當(dāng)受到壓力時(shí)候,還可以有少許的變形,起到緩沖壓力的作用。在這些纖維之間,散在分布著軟骨細(xì)胞,軟骨細(xì)胞由淺層向深層逐漸由扁平樣至橢圓或圓形的細(xì)胞組成,這些軟骨細(xì)胞維持關(guān)節(jié)軟骨的正常代謝。

關(guān)節(jié)軟骨沒(méi)有神經(jīng)支配,也沒(méi)有血管,其營(yíng)養(yǎng)成分必須從關(guān)節(jié)液中取得,而其代謝廢物也必須排至關(guān)節(jié)液中,關(guān)節(jié)軟骨的這種營(yíng)養(yǎng)代謝必須通過(guò)關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng),使關(guān)節(jié)軟骨不斷的受到壓力刺激才行,所以關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)對(duì)于維持關(guān)節(jié)軟骨的正常結(jié)構(gòu)起重要的作用。關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞位于關(guān)節(jié)軟骨陷窩內(nèi)。幼稚的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞位于關(guān)節(jié)軟骨組織的表層,單個(gè)分布、體積較小、呈橢圓形,長(zhǎng)軸與關(guān)節(jié)軟骨表面平行,越向深層的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞體積之間增大呈圓形,細(xì)胞核圓形或卵圓形、染色淺,細(xì)胞質(zhì)弱嗜堿性,常見(jiàn)數(shù)量不一的脂滴。

成熟的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞多2-8個(gè)成群分布于關(guān)節(jié)軟骨陷窩內(nèi),這些關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞由同一個(gè)母細(xì)胞分裂增殖而成,稱(chēng)為同源細(xì)胞群。電鏡下,關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞有突起和皺褶,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和發(fā)達(dá)的高爾基復(fù)合體及少量的線粒體。在組織切片中,關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞收縮為不規(guī)則形,在軟骨囊和細(xì)胞之間出現(xiàn)較大的腔隙。體外培養(yǎng)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞對(duì)于研究其生理功能、藥物作用以及各種致病因素作用下的病理生理改變具重要意義。

大鼠軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定方法

大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)主要試劑

PBS磷酸緩沖液、軟骨細(xì)胞組織消化液I、軟骨細(xì)胞組織消化液II、大鼠軟骨細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)基、雙抗溶液、40μM細(xì)胞篩、培養(yǎng)皿、巴氏管、解剖工具等

大鼠軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定方法

大鼠關(guān)節(jié)軟骨分離培養(yǎng)步驟

D1

1.把新生鼠(5-6D)以腹面朝下的姿勢(shì)固定上,用針固定前腿。用剪刀和鉗子去除后腿上的皮膚和軟組織,使股骨脫位并丟棄軟組織;

2.使用手術(shù)刀將股骨頭、股骨髁和脛骨分離(圖2b),并放置在PBS中。

關(guān)節(jié)軟骨看起來(lái)像一個(gè)規(guī)則的半透明小球體,而骨骼看起來(lái)是棕色的。

3.PBS沖洗兩次

4. 將軟骨片于10 mL組織消化液I中,在37℃培養(yǎng)箱消化45 min。

5. 吸出軟骨將其放入一個(gè)新的培養(yǎng)皿中。加入新鮮的10 mL組織消化液I中,在37℃培養(yǎng)箱消化45 min。

6. 用移液管攪拌組織碎片以分離軟組織。提取軟骨碎片,并將其放入一個(gè)新的培養(yǎng)皿中,加入10 mL消化液II,4 ℃,過(guò)夜消化。

D2

1.將10 mL含有殘留軟骨的消化液II放入一個(gè)15 mL的試管中。將溶液依次通過(guò)25、10、5、2毫升的巴斯德移液管,以分散任何細(xì)胞聚集物。這就產(chǎn)生了分離細(xì)胞的懸浮液。

3.將細(xì)胞懸液通過(guò)40μM細(xì)胞篩,然后室溫400g離心10 min,棄上清。

4.用5 mL PBS清洗并離心,然后用15 mL完全培養(yǎng)基重懸沉淀。

5.用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)軟骨細(xì)胞。為了檢測(cè)提取細(xì)胞的活力,進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色,平均每只大鼠獲得106個(gè)軟骨細(xì)胞。

6.在培養(yǎng)皿上以8x103/cm2細(xì)胞的密度種板軟骨細(xì)胞。置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱。

A. iMACs的培養(yǎng)(6-7D)

iMACs在第6-7天達(dá)到融合。培養(yǎng)2d后更換添加FCS的培養(yǎng)基。在第2、3、5、6d時(shí),細(xì)胞狀態(tài)圖如圖2e-h所示。

iMACs在第6-7天達(dá)到融合形態(tài)圖

大鼠軟骨細(xì)胞不同培養(yǎng)皿細(xì)胞量還有培養(yǎng)基建議

大鼠肋軟骨的分離

D1

1.將大鼠置于固定臺(tái),腹面朝上,用針固定前后腿。將皮膚從肚臍切開(kāi)到胸骨,然后用剪刀和鉗子沿著肋骨切開(kāi)(圖3a)。

2.切開(kāi)橫膈肌,并清除胸腔內(nèi)的所有軟組織(即肺和心臟)(圖3b)。

3.用剪刀取出肋骨(圖3c)。放置于PBS中。用手術(shù)刀去除皮膚和軟組織。(圖3d)。

鈣化肋骨看起來(lái)呈棕色(圖3d)。

4.用PBS沖洗兩次。

5. 將肋軟骨片置于15 mL消化液I中,在37℃培養(yǎng)箱消化45 min。

6. 用移液管攪拌組織碎片以分離軟組織。提取軟骨碎片,并將其放入一個(gè)新的培養(yǎng)皿中,加入10 mL組織消化液II,在4℃,過(guò)夜消化。

D2

1.向500 mL培養(yǎng)基中加入50 ml FCS。

2.將15 mL含有殘留軟骨的組織消化液II放入一個(gè)15 mL的試管中。將溶液依次通過(guò)25、10、5、2毫升的巴斯德移液管,以分散任何細(xì)胞聚集物。這就產(chǎn)生了分離細(xì)胞的懸浮液(圖2d)。

3.將細(xì)胞懸液通過(guò)40μM細(xì)胞篩,然后室溫400g離心10 min,棄上清。

4.用10 mL PBS清洗并離心,然后用40 mL添加FCS的培養(yǎng)基重懸沉淀。

5.用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)軟骨細(xì)胞。為了檢測(cè)提取細(xì)胞的活力,進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色,平均每只大鼠獲得106個(gè)軟骨細(xì)胞。

6.在培養(yǎng)皿上以25x103/cm2細(xì)胞的密度種板軟骨細(xì)胞。置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱。。

未成熟大鼠肋軟骨細(xì)胞在第6-7天達(dá)到融合。培養(yǎng)2d后更換添加FCS的培養(yǎng)基。在第6h、1、2、5d細(xì)胞狀態(tài)圖如圖3e-h所示。

大鼠肋軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)(6-7D)圖片

大鼠肋軟骨細(xì)胞不同培養(yǎng)皿細(xì)胞量還有培養(yǎng)基建議

大鼠軟骨細(xì)胞鑒定

1. 形態(tài)觀察

使用顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞的形態(tài)。匯合的iMAC表現(xiàn)出典型的軟骨細(xì)胞形態(tài),圓形或多邊形,細(xì)胞質(zhì)呈顆粒狀

2. 標(biāo)志物鑒定

檢測(cè)iMACs原代培養(yǎng)中軟骨細(xì)胞分化的主要標(biāo)志物,II型膠原和蛋白聚糖的表達(dá);

體外培養(yǎng)6d后的合成富含II型膠原蛋白和蛋白多糖的基質(zhì),對(duì)II型膠原蛋白進(jìn)行免疫熒光檢測(cè),阿爾新藍(lán)染色確定ECM中存在蛋白多糖的基質(zhì)(硫酸化蛋白聚糖)

大鼠軟骨細(xì)胞標(biāo)志物鑒定

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