人皮膚成纖維細胞背景簡介

人真皮成纖維細胞分離自皮膚組織內(nèi)的真皮層;皮膚組織來源包括頭部、臉部、手、腳、腿、背部、腹部、包皮等體表部位皮膚，可依據(jù)需求選用;真皮，位于表皮深層，向下與皮下組織相連，真皮結(jié)締組織的膠原纖維和彈性纖維互相交織在一起，埋于基質(zhì)內(nèi)。其內(nèi)分布著各種結(jié)締組織細胞和大量的膠原纖維彈性纖維，使皮膚既有彈性，又有韌性。其由兩層組成——乳頭層與網(wǎng)狀層。

真皮的結(jié)構(gòu)組成是膠原蛋白、彈性纖維以及基質(zhì)。成纖維細胞(Fibroblast)是疏松結(jié)締組織的主要細胞成分，由胚胎時期的間充質(zhì)細胞分化而來。成纖維細胞較大，輪廓清楚，多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結(jié)構(gòu)，其細胞核呈規(guī)則的卵圓形，核仁大而明顯。成纖維細胞功能活動旺盛，細胞質(zhì)嗜弱堿性，具明顯的蛋白質(zhì)合成和分泌活動，在一定條件下，它可以實現(xiàn)跟纖維細胞的互相轉(zhuǎn)化;成纖維細胞對不同程度的細胞變性、壞死和組織缺損的修復(fù)有著十分重要的作用。

人皮膚成纖維細胞分離,鑒定及傳代方法

人皮膚成纖維細胞分離培養(yǎng)所需試劑及器械

皮膚成纖維細胞專用培養(yǎng)基，10cm培養(yǎng)皿，六孔板，T175培養(yǎng)瓶，手術(shù)刀，手術(shù)鑷子及相關(guān)解剖器械，HSF組織消化液，胎牛血清，雙抗，慶大霉素

人皮膚成纖維細胞分離操作流程

酶消化

1. 獲取要求組織寬度大于3mm。在手術(shù)室中將組織置于預(yù)冷至4℃、含0.5%雙抗的無菌PBS緩沖液中，保證組織完全浸沒

2. 用含0.5%雙抗的PBS緩沖液反復(fù)沖洗組織塊10~15遍，直至組織塊表面無肉眼可見的污物。

3. 再次用含0.5%雙抗的PBS緩沖液沖洗處理后的組織塊，并用眼科剪剪成約5mm×5mm的小塊，完全浸入HSF組織消化液I中，將1.5 mL離心管用錫紙包裹緊密以避光，置于4℃冰箱中消化18~20h。

4. 次日，采用酶消化法處理組織塊。將1.5 mL EP管取出，于超凈臺中打開，用含0.5%雙抗的PBS緩沖液反復(fù)沖洗。撕下真皮層.

5. 置于加入了HSF組織消化液II的培養(yǎng)皿中，用眼科剪輕柔地將上皮盡量剪碎，防止破壞培養(yǎng)皿底部導(dǎo)致污染。完全剪碎后，將培養(yǎng)皿蓋好并用封口膜封住，置于細胞培養(yǎng)箱中消化15 min，每隔5 min取出至超凈臺中反復(fù)吹打混勻。

6. 15 min后，加入1mL胎牛血清終止消化，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，1000r/min離心5min，吸去上清

7. 用5ml人皮膚成纖維專用培養(yǎng)基重懸，轉(zhuǎn)移至T25細胞培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)

人皮膚成纖維細胞鑒定觀察

1. 形態(tài)觀察

成纖維細胞剛接種的細胞也呈球形，貼壁后，胞體呈梭形或三角形，有2-3個長短不一的突起，胞核橢圓形，位于胞體中間，無異常核分裂相;細胞匯合后，排列緊密，呈典型漩渦狀、放射狀走行。成纖維細胞具有細長的紡錘狀細胞體的特征形態(tài)特征，圓形至橢圓形細胞核，并且成纖維細胞在匯合時成對生長并成束生長。培養(yǎng)基支持成纖維細胞的生長，而其他細胞群(例如角質(zhì)形成細胞)需要額外的補充劑和生長因子，或者在有絲分裂上活性較低，這允許相對純的成纖維細胞培養(yǎng)。

剛分離的真皮成纖維細胞呈圓形、折光性良好，懸浮于培養(yǎng)基中。30min細胞貼壁，其中部分開始伸出偽足，表現(xiàn)為小的突起；6h后細胞基本貼壁完全，伸展成梭形，胞核清晰，分布較均勻，散在生長，不聚集成團;細胞生長迅速，5-7天即呈融合狀態(tài)，細胞排列緊密，有的交叉重疊生長，平坦、胞體較大，細胞質(zhì)透明，細胞核較大，呈橢圓形，顏色淡。細胞融合，并彼此連接成網(wǎng)狀;細胞呈突起的紡錘形或星形的扁平分布。真皮成纖維細胞在生理條件下的主要功能包括：構(gòu)造和維持組織的正常形態(tài)，合成和釋放細胞外基質(zhì)以及組織損傷后及時大量聚集修復(fù)損傷組織。

2. 標志物檢測

維細胞抗SERPINH1(也稱為HSP-47)，它是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的膠原特異性分子伴侶。HSP47在皮膚成纖維細胞的膠原蛋白生物合成中起著至關(guān)重要的作用。