一、準(zhǔn)備工作

1. 將IMMOCELL Reactive detergent(活性保持培養(yǎng)基)，稀釋好的IMMOCELL Antibacterial detergent stock和IMMOCELL MLDT-Target digestive solutions(專用消化液)于4度預(yù)冷2小時(shí)以上，將1ml無菌槍頭和200ul無菌槍頭封口后于-20度預(yù)冷12小時(shí)以上。

2.將IMMOCELL MLDT organoid conditioned mediumm(MLDT-條件培養(yǎng)基)，MLDT organoid supplement A(10X MLDT-補(bǔ)充劑A)，MLDT organoid supplement B(200XMLDT-補(bǔ)充劑B)和Specialized buffers(PH緩沖液)于常溫化凍后，配制成完全培養(yǎng)基，4℃保存。

3. 將10cm精細(xì)手術(shù)剪，12cm精細(xì)手術(shù)鑷子，15cm常規(guī)平頭鑷子和3號(hào)手術(shù)到高溫高壓滅菌后，和提前準(zhǔn)備好的碎冰1000g于紫外下消殺30min。

二、小腸組織獲取

1.小鼠脫臼處死后，浸在75%乙醇中2分鐘，后續(xù)將小鼠拿進(jìn)無菌生物安全柜中繼續(xù)操作，后續(xù)所有用到物品均經(jīng)過滅菌處理。

2.解剖小鼠，將小鼠小腸取出，取適量長(zhǎng)度的小腸段10 cm左右，用稀釋好且4度預(yù)冷的IMMOCELL Antibacterial detergent stock浸泡，將小腸剪為1cm左右的組織塊，仔細(xì)將小腸外的腸系膜去除。去除腸系膜后縱向剪開小腸腸壁，用IMMOCELL Antibacterial detergent stock清洗3遍以上去除內(nèi)容物(組織所接觸到的環(huán)境均為冰上或4 ℃的環(huán)境)。

三、小腸隱窩分離

1.將三號(hào)手術(shù)刀和配套刀片在安全柜內(nèi)組裝后，用刀背輕輕刮除小腸內(nèi)壁的絨毛，盡量不要破壞其結(jié)果的完整性，刮除后用IMMOCELL Antibacterial detergent stock清洗2遍.

2.將處理好的干凈組織挑取到10cm無菌培養(yǎng)皿中，倒入少量IMMOCELL Reactive detergent(活性保持培養(yǎng)基),用無菌的10cm精細(xì)剪刀將組織切成糜狀后，收集于用抗粘附劑潤洗過的50ml離心管，加入20mlIMMOCELL Reactive detergent(活性保持培養(yǎng)基)，用抗粘附劑潤洗過的10ml離心管吹打20次，待沉降后去除上清液，再加入同體積的IMMOCELL Reactive detergent(活性保持培養(yǎng)基)清洗兩次(無需吹打).

3.清洗后去除上清，注意不要損失組織塊，用DPBS去除培養(yǎng)基殘留后，用10-12ml預(yù)冷的IMMOCELL MLDT-Target digestive solutions(專用消化液)重懸組織，轉(zhuǎn)移到15ml離心管中。做好標(biāo)記，備注小鼠品系，器官名稱和日期等，封口膜封好置于4度環(huán)境下的垂直混勻儀中等轉(zhuǎn)速消化45-60min。

4.消化結(jié)束后，冰上等組織沉降，吸去上清液再加入10-12mllIMMOCELL Reactive detergent(活性保持培養(yǎng)基)，然后用10 mL的槍進(jìn)行吹吸20次，此時(shí)會(huì)看到溶液變渾濁，可以吸取少量進(jìn)行鏡檢，觀察溶液內(nèi)隱窩的數(shù)量和完整度。

5.冰上靜置1分鐘，待組織沉降后，將上清過70 μM的細(xì)胞篩，收集過濾物，過濾物即為隱窩。(可多次用llIMMOCELL Reactive detergent(活性保持培養(yǎng)基)沖洗細(xì)胞篩上的組織獲得更多隱窩).

6.將收集的隱窩溶液用600 g離心10分鐘后去除上清，再加入1mlllIMMOCELL Reactive detergent(活性保持培養(yǎng)基)重懸沉淀物到1.5ml離心管中，100 g離心2分鐘，棄去上清，加1 mL llIMMOCELL Reactive detergent(活性保持培養(yǎng)基)，輕彈管壁重懸重復(fù)兩次，棄去上清后，視隱窩量加300-500 μL的完全培養(yǎng)基，輕彈管壁重懸。

四、注意事項(xiàng)

1.所有離心管，移液管都要用抗粘附劑潤洗避免組織黏附在其上;

2.所有組織為保持其活性都應(yīng)該在4度環(huán)境中保持，試劑用完后盡量插入冰上保持溫度;

3.最后一次重懸1.5ml后的細(xì)胞沉淀重懸不可吹打，通過敲打離心管重懸。