細胞簡介

神經(jīng)干細胞分離自腦皮層組織;大腦分左右兩個半球，大腦皮質(zhì)(灰質(zhì))覆蓋著每個大腦半球的大部分，它是神經(jīng)元胞體集中的地方。內(nèi)部則是由神經(jīng)纖維或髓鞘構(gòu)成的白質(zhì)。每一個半球都有三個面，即外側(cè)面(約占整個皮質(zhì)面積的1/3)、內(nèi)側(cè)面和底面(占2/3的面積);半球表面有很多深淺不等的溝或裂，溝或裂之間的隆起叫回，它們大大增加了大腦的表面積;大腦外側(cè)面重要的溝、裂有大腦外側(cè)裂、頂枕裂和中央溝。由于三溝裂之界隔，使大腦皮質(zhì)組分為額葉、頂葉、顳葉、枕葉四大部分。神經(jīng)干細胞具有分化為神經(jīng)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞的能力，能自我更新，并足以提供大量腦組織細胞的細胞群。神經(jīng)干細胞是一類具有分裂潛能和自更新能力的母細胞，它可以通過不對等的分裂方式產(chǎn)生神經(jīng)組織的各類細胞。需要強調(diào)的是，在腦脊髓等所有神經(jīng)組織中，不同的神經(jīng)干細胞類型產(chǎn)生的子代細胞種類不同，分布也不同。神經(jīng)干細胞作為干細胞的一種，它具有其它所有干細胞的基本特征：具有自我維持和自我更新能力，具有多種分化潛能，具有分化為本系統(tǒng)大部分類型細胞的能力，這種自我更新和分化潛能可以維持相當(dāng)長的時間甚至終生，對損傷和疾病具有反應(yīng)能力。神經(jīng)干細胞在疾病、損傷狀態(tài)下具有增殖、遷移，并向神經(jīng)細胞、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞分化的能力，已成為神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)和再生研究的熱點，體外建立穩(wěn)定的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)模型是其基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用的前提。神經(jīng)干細胞在培養(yǎng)3-4 d后，可形成神經(jīng)球，神經(jīng)球在培養(yǎng)基中呈懸浮生長，予以更換半量培基，1周后用吸管輕柔吹打球形克隆成為小的神經(jīng)球和單細胞懸液，將部分細胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，2×105個細胞/瓶，每7-10 d傳代1次，每隔3 d離心更換半量培養(yǎng)基1次，培養(yǎng)條件不變。

實驗工具

NSC神經(jīng)干細胞完全培養(yǎng)基(IMP-R152-1)、NSC神經(jīng)干細胞專用消化液 ( IMP-R152-1C )、PBS磷酸緩沖液、顯微剪、微型剪刀、40 微米細胞篩、6 厘米 培養(yǎng)皿、10 厘米 培養(yǎng)皿、15 毫升離心管

操作過程

提前開啟紫外線照射超凈臺30 分鐘。將培養(yǎng)基和添加劑室溫融化，使用前室溫中預(yù)溫10-30 分鐘。紫外照射完畢后，75%酒精消毒超凈臺，超凈臺通風(fēng)10 分鐘以上。

1將新生小鼠(1-3天)放到6 厘米細胞培養(yǎng)皿蓋上，噴酒精后放置超凈工作臺中。

2.在6 厘米培養(yǎng)皿中入2-3 毫升 PBS緩沖液

3.將新生鼠的頭直接剪下來，放入PBS緩沖液中漂洗掉血漬

4.在6 厘米細胞培養(yǎng)皿中加入500-1000 微升 PBS緩沖液

5.取腦：用微型剪刀將腦沿中縫剪開腦皮和腦殼沿著開口起始處和終點處兩邊橫向各剪一刀用剪刀將嗅球連接處挑斷，把整個腦取出放入剛剛倒好的PBS緩沖液中。

6.取下丘腦神經(jīng)干細胞:將整腦翻面，腹面朝上

下丘腦在整腦中間腹面突出部，沿著一條腦縫切三刀，邊緣修整一下后，用鑷子夾斷2/3處，取上方(即腹面)2/3的腦

7.在6 厘米培養(yǎng)皿中加入500 微升 NSC神經(jīng)干細胞專用消化液，將取好的下丘腦組織塊放入其中，用鑷子夾住刀片，切碎腦組識，直到?jīng)]有大的組織塊出現(xiàn)即可。.

8.補1500 微升的NSC神經(jīng)干細胞專用消化液，將6 厘米培養(yǎng)皿蓋上蓋子放入培養(yǎng)箱中(37℃)消化20-30 分鐘。

9.消化結(jié)束后加入PBS緩沖液稀釋消化液，轉(zhuǎn)移到15 毫升離心管中，最終PBS緩沖液的體積為消化液體積的3倍即可

10.吹打混勻后，置于離心機2000轉(zhuǎn)，離心15分鐘

11.用泵吸掉上清，盡量吸干凈，加入NSC完全培養(yǎng)液(要分多少個孔就加多少毫升)

12.吹打混勻后，用40 微米 細胞篩過濾入培養(yǎng)皿中，補2 毫升完全培養(yǎng)液夜即可

13.一般一周后分細胞

細胞傳代

懸浮細胞 (6厘米培養(yǎng)皿)

1.將上清吸入15 毫升管中

2.用1毫升 PBS緩沖液潤洗2次，加入15 毫升管中

3.高心，2000 轉(zhuǎn)，15 分鐘 (水平離心機)

4.吸去上清，加入500 微升 消化液，放入培養(yǎng)箱中橫放5-10 分鐘(消化好后，會變成絮狀，輕輕吹打則變透明)

6.加入1500 微升 PBS緩沖液稀釋消化液，吹打幾次，至溶液變澄清

6.離心，轉(zhuǎn) rpm，5 分鐘

7.吸去上清，用新鮮NSC培養(yǎng)基重懸，分盤

細胞凍存

消化后使用10% DMSO 的神經(jīng)干細胞完全培養(yǎng)基凍存

細胞鑒定

1. 形態(tài)觀察

神經(jīng)干細胞一般都是懸浮培養(yǎng)的，會形成神經(jīng)球

2. 標(biāo)志物鑒定

小鼠下丘腦神經(jīng)干細胞經(jīng)Sox2及Nestin免疫熒光鑒定，純度可達90%以上

3. 誘導(dǎo)實驗

神經(jīng)球培養(yǎng)和分化實驗，染色要貼壁，需要加層粘連蛋白La分鐘in或者poly-lysine，NSC可以分化為神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞