FTC-133人濾泡狀甲狀腺癌細胞背景簡介

人甲狀腺癌細胞源自一名42歲患有濾泡狀甲狀腺癌的男性的淋巴結轉移灶。表達甲狀腺球蛋白、EGFR，P53突變。碘131輻射可使FTC-133細胞攝碘能力下降。

FTC-133人甲狀腺癌細胞系 是一種由扁平多邊形變?yōu)樗笮蔚募谞钕侔┘毎怠＿@些細胞保留了分化的甲狀腺細胞功能和甲狀腺細胞對甲狀腺素和局部活性生長因子的反應。此外，甲狀腺球蛋白免疫反應也可見于這種細胞系。

FTC-133人甲狀腺癌細胞系是一種來源于人甲狀腺癌的腫瘤細胞系。這種細胞系已經被廣泛應用于甲狀腺癌的研究中，包括腫瘤發(fā)生機制、藥物篩選和治療等方面。

FTC-133人甲狀腺癌細胞系通常通過將人甲狀腺癌組織中的腫瘤細胞分離出來，經過體外培養(yǎng)和傳代，最終得到穩(wěn)定的細胞系。這些細胞具有多向分化潛能，可以分化為甲狀腺上皮細胞、濾泡細胞和髓樣細胞等不同類型的細胞。

由于FTC-133人甲狀腺癌細胞系具有高度的增殖能力和分化能力，因此被廣泛應用于甲狀腺癌的研究中。

FTC-133細胞形態(tài)特征

FTC-133人濾泡狀甲狀腺癌細胞產品信息

細胞名稱：FTC-133人濾泡狀甲狀腺癌細胞

細胞別稱：FTC-133; FTC133; 人甲狀腺癌細胞

種屬來源：人，42歲

組織來源：甲狀腺

形態(tài)特性：貼壁生長，上皮細胞樣

STR位點信息：Amelogenin：X,X;CSF1PO：10,10;D12S391：21,22;D13S317：11,11;D16S539：11,11;D18S51：11,11;D19S433：12,13;D21S11：32.2,32.2;D2S1338：20,20;D3S1358：15,15;D5S818：12,12;D6S1043：19,19;D7S820：9,10;D8S1179：10,10;FGA：21,21;Penta E：13,13;TH01：9.3,9.3;TPOX：9,9;vWA：15,18;

保藏機構：ECACC; ICLC; 中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞資源中心

培養(yǎng)基：90%1640+10%FBS+PS

培養(yǎng)條件：氣相：95%空氣+5%二氧化碳;溫度：37℃

凍存條件：無血清凍存液，液氮儲存

FTC-133人濾泡狀甲狀腺癌細胞培養(yǎng)操作說明

細胞培養(yǎng)的基本條件

實驗室條件

1.無菌環(huán)境：無菌室包括更衣室，緩沖間，風淋間，操作間

2.儀器設備：超凈工作臺-操作平臺、CO2培養(yǎng)箱-細胞生長的環(huán)境、倒置顯微鏡-觀察細胞、離心機-離心收集細胞、冰箱-放置培養(yǎng)基等試劑、水浴鍋-復蘇細胞、真空泵-收集廢液、滅菌鍋-滅菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-凍存細胞、純水儀-制備一級水

3.器材耗材：玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、巴士管、離心管、移液槍、槍頭(白色0-10ul;黃色20-200ul;藍色100-1000ul)、濾器，吸管，多孔培養(yǎng)皿、6cm皿、10cm皿，培養(yǎng)瓶等。

4.試劑：1640基礎培養(yǎng)基、FBS胎牛血清、雙抗、胰酶(0.25%Trypsin-0.02%EDTA)、pbs

操作者工作范疇

1.無菌操作：洗手，戴手套，穿實驗服，常噴75%酒精

FTC-133人濾泡狀甲狀腺癌細胞復蘇步驟

1)準備：紫外線照臺30min，提前打開水浴鍋設置37℃，培養(yǎng)基臨用前放水浴箱里溫育20分鐘(或者放在超凈工作臺常溫放30min)。在操作臺上擺放好物品，左邊放完全培養(yǎng)液，1mL槍頭(已滅菌)，培養(yǎng)皿，右上角放廢液缸，1mL移液槍，3mL巴氏管。檢查離心機，廢液泵。

2)待水浴鍋溫度達到37℃時，戴上手套和護目鏡，從-196℃液氮罐中取出凍存管，將含有1mLFTC-133細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，同時不斷輕輕搖動凍存管，盡量保證凍存管內細胞1min內融化，加4mL培養(yǎng)基混合均勻，移入離心機中100rpm離心3min，以75%酒精噴凍存管外部，移入無菌操作臺內。

3)用3mL巴氏管取5mL新鮮培養(yǎng)基到一個新的6cm培養(yǎng)皿中，(若離心后細胞量較多，可取12mL新鮮培養(yǎng)基到一個新的10cm培養(yǎng)皿中)，標記日期、所用培養(yǎng)基名稱和細胞名稱。

4)用廢液泵(吸力不要太大)取一個黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取1mL新鮮培養(yǎng)基重懸細胞后(充分混勻)，將FTC-133細胞懸液加入到培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺上以畫“8”字法鋪勻細胞(一般培養(yǎng)皿在臺子上畫30個8字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測是否鋪勻細胞。

5)確定FTC-133細胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入CO2培養(yǎng)箱過夜。(盡量平直放入不要晃動)，第二天換液并檢查細胞密度。

FTC-133人濾泡狀甲狀腺癌細胞傳代操作

從培養(yǎng)箱拿出FTC-133細胞，在顯微鏡下觀察細胞密度和細胞狀態(tài)，當FTC-133細胞狀態(tài)良好，且密度達到85%左右的時候即可進行傳代;

打開廢液泵，用廢液泵吸頭(吸力不要太大)取一個藍色槍頭吸走上清廢液，用巴士管取4ml不含鈣、鎂離子的1xPBS(6cm皿)到細胞培養(yǎng)皿中(若是10cm皿則取8ml1xPBS)，輕輕晃動以清洗細胞表面1-2次;

用廢液泵吸走PBS廢液，加1mL消化液(0.25%Trypsin-0.02%EDTA)于培養(yǎng)瓶中，拿起培養(yǎng)皿輕輕轉動以便胰酶浸泡到每個細胞，消化1-3min(根據細胞貼壁情況判斷，貼壁較牢的消化時間長一點或者放入CO2培養(yǎng)箱中消化幾分鐘)后，在顯微鏡下觀察細胞是否變圓變亮，一旦發(fā)現大量細胞胞質回縮，細胞間隙增大，即將脫離培養(yǎng)皿底，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

用1ml移液槍輕柔吹打，保證培養(yǎng)皿底的每個角落都吹打到，邊緣處也不能忽略(吹打時盡量避免產生氣泡，因其對細胞有傷害;需輕柔吹打，用力吹打對細胞也有傷害)，把培養(yǎng)瓶中所有細胞懸液用吸1ml移液槍移入無菌離心管中。

將裝有FTC-133細胞懸液的離心管放入離心機中(配平)，1000轉離心3-5min，用廢液泵取一個黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取1-2mL新鮮培養(yǎng)基重懸細胞后(充分混勻)，將細胞懸液按1:2比例分到新的含8mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺上以畫“8”字法鋪勻細胞(一般培養(yǎng)皿在臺子上畫30個8字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測是否鋪勻細胞。

確定FTC-133細胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(盡量平直放入不要晃動)。第二天再觀察細胞密度。

FTC-133人濾泡狀甲狀腺癌細胞凍存準備

從培養(yǎng)箱拿出FTC-133細胞，在顯微鏡下觀察細胞密度和細胞狀態(tài)，待細胞生長狀態(tài)良好且存活率高的狀態(tài)下，細胞密度達80–90%時，可進行細胞凍存操作，以T25瓶為例

細胞凍存步驟

a.收集細胞及細胞培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶內所有培養(yǎng)基轉入無菌離心管，裝入無菌離心管中，1000rpm條件下離心4min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數。

b.根據細胞數量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，在FTC-133細胞凍存管上貼上細胞標簽(細胞標簽上包含：細胞名稱、凍存日期、培養(yǎng)用的培養(yǎng)基)。

c.將凍存管入庫到-80度凍存盒里，放置24小時后，即可移入液氮中保存，標記好入庫位置和凍存日期。

FTC-133人濾泡狀甲狀腺癌細胞應用

人甲狀腺癌細胞可以用于甘露糖結合凝集素對甲狀腺癌細胞增殖、凋亡及相關蛋白表達影響的研究

用不同濃度的甘露糖結合凝集素(Mannan-binding lectin,MBL)分別作用于甲狀腺乳頭狀癌細胞(K1)和甲狀腺濾泡狀癌細胞(FTC-133),采用4-甲基偶氮四唑藍(MTT法)檢測細胞增殖,選擇適量的濃度及作用時間,應用流式細胞術(Flow Cytometry,FCM)檢測細胞凋亡,蛋白印記法(Western blot)檢測兩種癌細胞中Bcl-2和p53蛋白表達,探討MBL與甲狀腺腫瘤細胞增殖、凋亡的關系,為MBL用于防治甲狀腺腫瘤提供理論依據。

方法

1. 細胞培養(yǎng):人甲狀腺乳頭狀癌(K1)和甲狀腺濾泡狀癌(FTC-133)細胞,分別培養(yǎng)于含有10%胎牛血清,100U/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素、DMEM:F12:MCDB105(2:1:1)和DMEM-F12(1:1)的培養(yǎng)基中,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),23天換液1次。用0.25%胰酶常規(guī)消化傳代,取對數生長期細胞進行實驗。

2. MTT法檢測細胞增殖:分別將甲狀腺乳頭狀癌細胞(K1)、甲狀腺濾泡狀癌細胞(FTC-133)與不同濃度的MBL(濃度分別為0、0.01、0.1、1、10ug/ml,每個濃度設5個復孔,0ug/LMBL為對照組)共培養(yǎng)12、24、48h后,MTT細胞增殖試驗檢測MBL對兩種細胞生長的影響。

3. 流式細胞術檢測細胞凋亡率:將甲狀腺乳頭狀癌細胞(K1)和甲狀腺濾泡狀癌細胞(FTC-133)分別與0、1ug/mlMBL共培養(yǎng)48h后,流式細胞儀Annexin V-FITC/PI法觀察MBL對兩種甲狀腺癌細胞凋亡的影響。

4. Bcl-2及p53基因蛋白表達的測定:提取實驗組與對照組細胞中的總蛋白,以β-actin作為內參,蛋白印記法(Western blot)測定1ug/mlMBL分別作用于甲狀腺乳頭狀癌細胞(K1)和甲狀腺濾泡狀癌細胞(FTC-133)48h后,Bcl-2及p53基因蛋白的相對表達量。

結果

1. MTT法檢測結果:MBL作用于甲狀腺乳頭狀癌及甲狀腺濾泡狀癌細胞后,各組細胞生長均受到抑制,并呈劑量、時間依賴關系。

2. 流式細胞術檢測細胞凋亡率:MBL作用于甲狀腺乳頭狀癌(FTC-133)及甲狀腺濾泡狀癌細胞(K1),檢測到明顯的凋亡峰,1ug/ml的MBL作用48h后甲狀腺乳頭狀癌細胞(FTC-133)凋亡率為(12.87±0.47)%,而未經MBL作用的對照組凋亡率為(5.15±0.52)%,二者差異具有統計學意義(p<0.05)。1ug/ml的MBL作用48h后甲狀腺濾泡狀癌細胞(K1)凋亡率為(9.36±0.35)%,而未經MBL作用的對照組凋亡率為(3.24±0.71)%,二者差異具有統計學意義(p<0.05)。

3. Bcl-2及p53基因蛋白表達的測定

3.1 Bcl-2蛋白的相對表達量

3.1.1甲狀腺乳頭狀癌細胞(K1):Western blot結果顯示26KD處有一個條帶,密度掃描分析結果對照組為:(1.20±0.07),實驗組為:(0.59±0.04),實驗組與對照組相比Bcl-2蛋白相對表達量明顯下調,差異有統計學意義(p<0.05)。

3.1.2甲狀腺濾泡狀癌細胞(FTC-133):Western blot結果顯示26KD處有一個條帶,密度掃描分析結果對照組為:(1.07±0.11),實驗組為:(0.33±0.06),實驗組與對照組相比Bcl-2蛋白相對表達量明顯下調,差異有統計學意義(p<0.05)。

3.2 p53蛋白的相對表達量

3.2.1甲狀腺乳頭狀癌細胞(K1):Western blot結果顯示53KD處有一個條帶,密度掃描分析結果對照組為:(1.51±0.29),實驗組為:(0.74±0.07),實驗組與對照組相比p53蛋白相對表達量明顯下調,差異有統計學意義(p<0.05)。

3.2.2甲狀腺濾泡狀癌(FTC-133):Western blot結果顯示53KD處有一個條帶,密度掃描分析結果對照組為:(0.88±0.14),實驗組為:(0.35±0.08),實驗組與對照組相比p53蛋白相對表達量明顯下調,差異有統計學意義(p<0.05)。

結論

1. MBL在體外具有抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞及甲狀腺濾泡狀癌細胞增殖的作用,這種作用與劑量、時間呈正相關。

2. MBL在體外可促進甲狀腺乳頭狀癌細胞及甲狀腺濾泡狀癌細胞凋亡,為以后MBL用于甲狀腺癌防治提供理論基礎。

3. MBL可誘導甲狀腺癌細胞凋亡、抑制其增殖,在其誘導甲狀腺癌細胞凋亡、促進其增殖的的過程中,Bcl-2和p53可能發(fā)揮著一定的作用。

FTC-133人甲狀腺癌細胞系可以用于SLC27A2/FATP2在分化型甲狀腺癌增殖和遷移中的作用及機制研究

探討DUSP5介導FTC-133人甲狀腺癌細胞系遷移增殖作用人甲狀腺濾泡癌細胞系(FTC-133)分為以下4組:A:DUSP5過表達質粒轉染FTC-133(DUSP5);B:空載對照質粒轉染FTC-133(NC);C:DUSP5小干擾轉染FTC-133(siDUSP5);D:空載對照小干擾轉染FTC-133(siNC)。western blotting和qRT-PCR檢測DUSP5的干預效果。根據Transwell檢測細胞遷移、侵襲能力,EdU檢測細胞增殖能力,western blotting檢測遷移相關蛋白分子的表達情況。

KEGG富集分析明確FTC與PTC差異基因所富集關鍵通路并進行體外驗證進一步通過對三個數據集差異表達基因進行KEGG富集分析發(fā)現,MAPK信號通路在三個數據集中均富集顯著,提示我們MAPK信號通路在介導FTC與PTC生物學行為差異方面發(fā)揮重要作用。我們分別應用MAPK信號通路中三個亞通路的抑制劑以Edu、Transwell驗證三個亞通路(ERK MAPK,JNK,p3 8 MAPK)在FTC細胞中發(fā)揮的作用。進一步以western blotting檢測干預DUSP5的表達后MAPK信號通路的三個亞通路的激活情況,隨后Edu、Transwell明確DUSP5與其激活的MAPK亞通路對FTC-133人甲狀腺癌細胞系細胞增殖、遷移以及侵襲的影響。

統計學分析統計學分析:數據以均數±標準差(mean±SE)表示,使用SPSS 22.0統計軟件進行統計分析,兩組間數據的比較使用非配對t檢驗。若P<0.05,則認為有統計學意義(雙側),若P<0.01,則認為有顯著統計學意義(雙側)。

研究結果

1. 數據庫綜合分析結果:GEO數據庫篩選發(fā)現GSE27155,GSE53157和GSE29315三個數據集符合納入標準,共包含26個FTC樣本,67個PTC樣本,經GEO2R工具進行差異表達基因分析并以Venn進行匯總(圖1.2),發(fā)現有26個基因(見表1)在這三個數據庫中均差異表達。這26個差異表達基因中有2個在FTC中表達上調,24個表達下調(圖1.3)。對26個共同差異表達基因以cBioPartol數據庫中甲狀腺癌病人的臨床資料進行生存相關分析,我們發(fā)現這26個共同差異表達基因中DUSP5對于甲狀腺癌的生存率有明顯的影響(圖1.4)。

2. 驗證病理組織DUSP5的表達情況:免疫組化結果顯示,在FTC病理組織中DUSP5表達較少,而PTC病理組織中DUSP5大量表達(P<0.05)。在組織芯片中也得到相同的結果(P<0.05)。

3.細胞轉染DUSP5:轉染DUSP5過表達質粒、小干擾以及對應空白對照于FTC-133人甲狀腺癌細胞系細胞,western blottingting、RT-PCR驗證轉染效果,結果顯示:與空載對照質粒組相比,過表達質粒組DUSP5在蛋白水平和mRNA水平均表達增加(P<0.05),小干擾與對照組相比DUSP5表達降低(圖3.1)(P<0.05)。

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