Calu-3人肺癌細胞背景簡介

Calu-3細胞是從一名25歲的白人男性肺腺癌患者的胸水中分離建系的；該患者曾使用過環(huán)磷酰胺、博來霉素、阿霉素進行治療。

Calu-3表現(xiàn)出細支氣管上皮的許多特征，是一種cAMP依賴性Cl-分泌的人氣道上皮細胞系，可用于研究人類呼吸功能、結(jié)構(gòu)和炎癥反應(yīng)的模型。有檢測發(fā)現(xiàn)CALU-3有ErbB2基因的擴增，可表達組成型活性的ErbB2/Her2，以及野生型EGFR和突變型K-Ras (G13D)。此外，該細胞含有TP53和CDKN2A基因的突變，對藥物埃羅替尼和西妥昔單抗敏感，而這兩種藥物是針對ErbB受體的常用藥。

有研究表明Calu-3細胞可用于SARS-CoV-2的體外繁殖，是一種合適的轉(zhuǎn)染宿主，在癌癥和毒理學(xué)研究中具有廣泛應(yīng)用。CALU-3為上皮細胞樣，貼壁生長。干系染色體數(shù)目為亞三倍體，正常的1、13、15和17號染色體缺失，X染色體為二倍體?？稍诼闶篌w內(nèi)成瘤，形成分化良好的I級腺癌。

Calu-3人肺癌細胞形態(tài)特征

calu-3細胞形態(tài)呈上皮細胞樣，貼壁生長，常用在人類呼吸功能、結(jié)構(gòu)和炎癥反應(yīng)的模型研究上。

Calu-3人肺癌細胞產(chǎn)品信息

細胞名稱：Calu-3，人肺癌細胞

細胞別稱：CaLu-3; CALU-3; Calu 3; Calu3; CALU3;人肺腺癌細胞

種屬來源：人

年齡性別：男;25歲

組織來源：肺;轉(zhuǎn)移灶;胸水腺癌

生長特性：貼壁生長

細胞形態(tài)：上皮細胞樣

染色體：56~63，XX，有若干染色體易位

STR位點信息：Amelogenin：X;CSF1PO：11，12;D13S317：12;D16S539：12，14;D18S51：14，17;D19S433：12，13;D21S11：28，30;D2S1338：19;D3S1358：15，18;D5S818：11;D7S820：10，11;D8S1179：11，15;FGA：25;TH01：6，9.3;TPOX：8;vWA：16，17;

保藏機構(gòu)：ATCC; HTB-55 BCRJ; 0264

培養(yǎng)基：90%MEM+10% FBS+1%PS

培養(yǎng)條件：氣相：95%空氣+5%二氧化碳;溫度：37℃

凍存條件：無血清凍存液，液氮儲存

倍增時間：~35-45 hours

致瘤性：Yes, forms well differentiated grade I adenocarcinoma in nude mice.

抗原表達情況：Blood Type A; Rh+

基因表達情況：Blood Type A; Rh+

Calu-3人肺癌細胞培養(yǎng)操作說明

細胞培養(yǎng)的基本條件

實驗室條件

1. 無菌環(huán)境：無菌室包括更衣室，緩沖間，風(fēng)淋間，操作間

2. 儀器設(shè)備：超凈工作臺-操作平臺、CO2 培養(yǎng)箱-細胞生長的環(huán)境、倒置顯微鏡-觀察細胞、離心機-離心收集細胞、冰箱-放置培養(yǎng)基等試劑、水浴鍋-復(fù)蘇細胞、真空泵-收集廢液、滅菌鍋-滅菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-凍存細胞、純水儀-制備一級水

3. 器材耗材：玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、巴士管、離心管、移液槍、槍頭(白色 0-10ul;黃色 20-200ul；藍色 100-1000ul)、濾器，吸管，多孔培養(yǎng)皿、6cm 皿、10cm 皿，培養(yǎng)瓶等。

4. 試劑：MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、FBS胎牛血清、雙抗、胰酶(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)、pbs

操作者工作范疇

1. 無菌操作：洗手，戴手套，穿實驗服，常噴 75%酒精

Calu-3人肺癌細胞復(fù)蘇方法

1.準備：紫外線照臺 30min，提前打開水浴鍋設(shè)置 37℃，培養(yǎng)基臨用前放水浴箱里溫育20 分鐘(或者放在超凈工作臺常溫放 30min)。在操作臺上擺放好物品，左邊放完全培養(yǎng)液，1mL 槍頭(已滅菌)，培養(yǎng)皿，右上角放廢液缸，1mL 移液槍，3mL 巴氏管。檢查離心機，廢液泵。

2)待水浴鍋溫度達到 37℃時，戴上手套和護目鏡，從-196℃液氮罐中取出凍存管，將含有1 mLCalu-3細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，同時不斷輕輕搖動凍存管，盡量保證凍存管內(nèi)細胞 1min 內(nèi)融化，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻， 移入離心機中 100rpm 離心 3min，以 75%酒精噴凍存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。

3)用 3mL 巴氏管取 5mL 新鮮培養(yǎng)基到一個新的 6cm 培養(yǎng)皿中，(若離心后細胞量較多，可取 12mL 新鮮培養(yǎng)基到一個新的 10cm 培養(yǎng)皿中)，標記日期、所用培養(yǎng)基名稱和細胞名稱。

4)用廢液泵(吸力不要太大)取一個黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取 1mL 新鮮培養(yǎng)基重懸細胞后(充分混勻)，將Calu-3細胞懸液加入到培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺上以畫“8”字法鋪勻細胞(一般培養(yǎng)皿在臺子上畫 30 個 8 字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測是否鋪勻細胞。

5)確定Calu-3細胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入 CO2 培養(yǎng)箱過夜。(盡量平直放入不要晃動)，第二天換液并檢查細胞密度。

Calu-3人肺癌細胞傳代步驟

從培養(yǎng)箱拿出Calu-3細胞，在顯微鏡下觀察細胞密度和細胞狀態(tài)，當(dāng)細胞狀態(tài)良好，且密度達到 85%左右的時候即可進行傳代;

1.打開廢液泵，用廢液泵吸頭(吸力不要太大)取一個藍色槍頭吸走上清廢液，用巴士管取 4ml 不含鈣、鎂離子的1xPBS(6cm 皿)到細胞培養(yǎng)皿中(若是 10cm 皿則取 8ml 1xPBS)，輕輕晃動以清洗細胞表面1-2次;

2.用廢液泵吸走 PBS 廢液，加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)于培養(yǎng)瓶中，拿起培養(yǎng)皿輕輕轉(zhuǎn)動以便胰酶浸泡到每個細胞，消化5-7min(根據(jù)細胞貼壁情況判斷，貼壁較牢的消化時間長一點或者放入CO₂培養(yǎng)箱中消化幾分鐘)后，在顯微鏡下觀察細胞是否變圓變亮，一旦發(fā)現(xiàn)大量細胞胞質(zhì)回縮，細胞間隙增大，即將脫離培養(yǎng)皿底，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3.用 1ml 移液槍輕柔吹打，保證培養(yǎng)皿底的每個角落都吹打到，邊緣處也不能忽略(吹打時盡量避免產(chǎn)生氣泡，因其對細胞有傷害;需輕柔吹打，用力吹打?qū)毎灿袀?，把培養(yǎng)瓶中所有Calu-3細胞懸液用吸 1ml 移液槍移入無菌離心管中。

4.將裝有Calu-3細胞懸液的離心管放入離心機中(配平)，1000 轉(zhuǎn)離心 3-5min，用廢液泵取一個黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取 1-2mL 新鮮培養(yǎng)基重懸細胞后(充分混勻)，將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺上以畫“8”字法鋪勻細胞(一般培養(yǎng)皿在臺子上畫 30 個 8 字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測是否鋪勻細胞。

5.確定Calu-3細胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入 CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(盡量平直放入不要晃動)。第二天再觀察細胞密度。

Calu-3人肺癌細胞培養(yǎng)小貼士

1. Calu-3細胞不易消化，具體消化時間根據(jù)貼壁情況

2. Calu-3細胞貼壁較慢，建議處理后24h內(nèi)不要移動，防止影響細胞貼壁。

3. Calu-3細胞易抱團，所以建議放培養(yǎng)箱靜置消化5分鐘以上。

4. Calu-3細胞生長較慢，是正常狀態(tài)。

Calu-3人肺癌細胞凍存步驟

從培養(yǎng)箱拿出Calu-3細胞，在顯微鏡下觀察細胞密度和細胞狀態(tài)，待細胞生長狀態(tài)良好且存活率高的狀態(tài)下，細胞密度達 80–90%時，可進行細胞凍存操作，以T25 瓶為例

a.收集Calu-3細胞及細胞培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶內(nèi)所有培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無菌離心管，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數(shù)。

b.根據(jù)Calu-3細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×10⁶~1×10⁷/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液， 在細胞凍存管上貼上細胞標簽(細胞標簽上包含：細胞名稱、凍存日期、培養(yǎng)用的 培養(yǎng)基)。

c.將凍存管入庫到-80 度凍存盒里，放置 24 小時后，即可移入液氮中保存，標記好入庫位置和凍存日期。

Calu-3人肺癌細胞培養(yǎng)常見問題

1.Calu-3人肺癌細胞復(fù)蘇好幾天都不貼壁？

Calu-3細胞貼壁時間較長，消化處理傳代等操作后建議24h內(nèi)盡量不要移動，防止影響細胞貼壁，該細胞生長速度較慢，屬于正?，F(xiàn)象。

2.Calu-3人肺癌細胞成團怎么辦？

Calu-3細胞易抱團，建議放培養(yǎng)箱靜置消化5分鐘以上。Calu-3細胞不易消化，具體消化時間根據(jù)貼壁情況。

Calu-3人肺癌細胞特點

Calu-3細胞是一種人源性肺腺癌細胞系，其外觀和形態(tài)具有獨特的特點。在顯微鏡下觀察，Calu-3細胞呈現(xiàn)出典型的肺腺癌細胞的形態(tài)特征。

Calu-3細胞是一種橢圓形或不規(guī)則形狀的細胞，其大小約為10-15微米。細胞表面光滑，沒有突起或伸展。細胞的質(zhì)膜完整，沒有明顯的損傷或缺陷。

在細胞核方面，Calu-3細胞具有單個、圓形的細胞核。細胞核通常位于細胞的中央或稍微偏離中央位置。細胞核的直徑約為7-10微米。細胞核的染色質(zhì)呈現(xiàn)出均勻濃縮的狀態(tài)，沒有明顯的凝聚或分散。

除了細胞核外，Calu-3細胞還具有豐富的細胞質(zhì)。細胞質(zhì)呈現(xiàn)出顆粒狀的結(jié)構(gòu)，在顯微鏡下觀察，可以看到許多小顆粒彌散在細胞質(zhì)中。這些顆?？赡苁堑鞍踪|(zhì)、核酸或其他細胞器的組分。

Calu-3細胞的細胞間連接也是其形態(tài)的一個重要特點。細胞間連接是細胞膜上的一種結(jié)構(gòu)，可以將相鄰細胞緊密連接在一起。在Calu-3細胞中，細胞間連接顯示出較強的粘附力，使細胞能夠形成緊密的群體。

總的來說，Calu-3細胞具有典型的肺腺癌細胞形態(tài)特征，包括橢圓形或不規(guī)則形狀的細胞、單個圓形的細胞核、豐富的細胞質(zhì)和強大的細胞間連接。這些形態(tài)特征不僅對于研究肺腺癌的發(fā)生和發(fā)展具有重要意義，也為臨床診斷和治療提供了參考依據(jù)。

Calu-3人肺癌細胞應(yīng)用

用于細胞膜仿生殼聚糖基納米載體用于蛋白藥物的肺給藥治療研究

以msFGFR2c作為包載的目的蛋白,通過離子交聯(lián)法制備了載藥納米微粒PCCs/msFGFR2c,并以水溶性季銨鹽殼聚糖HTCC構(gòu)建HTCC/msFGFR2c為對照,測得PCCs/msFGFR2c和HTCC/msFGFR2c的粒徑分別在190nm和210nm左右,相應(yīng)表面電位分別在0.81mV和9.7mV左右。PCCs/msFGFR2c、HTCC/msFGFR2c的包封率分別在47.2%和27.19%左右,載藥量分別在9.4%和5.8%左右。原子力顯微鏡和透射電鏡顯示納米粒子形態(tài)為類球型。

體外釋藥試驗得出:在24h內(nèi),PCCs/msFGFR2c在pH=5.5和7.4的體外環(huán)境下釋放率分別達到了84%和76%,HTCC/msFGFR2c則分別為76%和70%,表明PCCs納米系統(tǒng)具有較好的藥物緩釋功能。體外細胞毒性實驗結(jié)果表明:當(dāng)PCCs納米粒(PCCs-NP)的濃度達到2.0mg/mL時,對MRC-5和Calu-3細胞均無毒性,而HTCC納米粒(HTCC-NP)的濃度達到0.5mg/mL時就已經(jīng)對MRC-5和Calu-3細胞有毒性,說明PCCs-NP的生物相容性優(yōu)于HTCC-NP。

細胞攝取實驗結(jié)果表明:MRC-5和Calu-3細胞攝取PCCs和HTCC及其納米載體粒子存在時間和濃度依賴性,在一定攝取時間和攝取濃度范圍內(nèi)呈正相關(guān)。熒光納米載體微粒在亞細胞水平的分布實驗得到:在2.0h內(nèi)被攝入的納米載體粒子主要分布在細胞Calu-3的細胞質(zhì)中,在細胞溶酶體內(nèi)沒有觀察到納米載體粒子。以Calu-3細胞建立Transwell呼吸道上皮細胞轉(zhuǎn)運模型。

TEER實驗結(jié)果顯示:在AP端加入濃度為0.125mg/mL的熒光標記PCCs-NP和HTCC-NP納米載體粒子作用4h,經(jīng)過24h后TEER值均能夠完全恢復(fù),表明兩者在該濃度作用4h內(nèi)對Calu-3細胞單層緊密連接結(jié)構(gòu)的影響是可逆的;但是在AP端加入濃度為0.25mg/mL的熒光標記納米粒子時,PCCs-NP對Calu-3單細胞層TEER的影響是可恢復(fù),而HTCC-NP對Calu-3細胞單層TEER的影響不可恢復(fù),表明此濃度作用下PCCs-NP對Calu-3細胞單層緊密連接結(jié)構(gòu)的影響是可逆的,而HTCC-NP對Calu-3細胞單層緊密連接結(jié)構(gòu)的影響則不可逆。轉(zhuǎn)運試驗結(jié)果表明:殼聚糖衍生物PCCs和HTCC制成納米粒子PCCs-NP、HTCC-NP后,其跨Calu-3細胞單層的轉(zhuǎn)運效率和表觀滲透系數(shù)Papp都有所提高。

免疫熒光實驗表明:在作用濃度為0.25mg/mL時,PCCs-NP對緊密連接蛋白ZO-1的表達幾乎沒有影響,PCCs和HTCC都能在不同程度上減弱ZO-1的表達,HTCC-NP則能夠完全抑制ZO-1的表達,表明兩種納米載體具有不同的跨上皮細胞層機制。建立博來霉素誘導(dǎo)的Wistar大鼠肺纖維化模型,通過肺給藥方式研究了負載msFGFR2c的納米系統(tǒng)對肺纖維化大鼠的療效。

大鼠的體重、肺組織HE及Massion染色、X光結(jié)果都表明PCCs/msFGFR2c納米系統(tǒng)對肺纖維化有明顯的抑制作用,且優(yōu)于自由msFGFR2c組。總的來說,本研究制備的仿生納米載體粒子具有良好的生物相容性,可以改善蛋白藥物的經(jīng)肺給藥治療效果,有望成為一種優(yōu)良的肺給藥蛋白藥物載體材料。

參考文獻

[1]Self assembling nanocomposites for protein delivery:Supramolecular interactions of soluble polymers with protein drugs[J].Stefano Salmaso,Paolo Caliceti.International Journal of Pharmaceutics.2013(1)

[2]Airway delivery of peptides and proteins using nanoparticles[J].Christophe Y.Dombu,Didier Betbeder.Biomaterials.2013(2)

[3]Chitosan-based drug nanocarriers:Where do we stand?[J].Marcos Garcia-Fuentes,Maria J.Alonso.Journal of Controlled Release.2012(2)

[4]Polyamidoamine dendrimers surface-engineered with biomimetic phosphorylcholine as potential drug delivery carriers[J].Lan Jia,Jian-Ping Xu,Hai Wang,Jian Ji.Colloids and Surfaces B:Biointerfaces.2011(1)

[5]房邦仁.細胞膜仿生殼聚糖基納米載體用于蛋白藥物的肺給藥治療[D].暨南大學(xué),2018.