UMNSAH/DF-1細胞介紹

UMNSAH/DF-1細胞是起源于10日齡的ELL-0雞蛋的雞細胞株，自發(fā)永生化。分離原代雞胚成纖維細胞并在培養(yǎng)液中培養(yǎng)，傳代直到衰老;在衰老過程中離心以保持細胞培養(yǎng)在30%到60%滿;不衰老的克隆進行鑒定并傳代不少于30次。在軟瓊脂上沒有觀察到克隆增殖，說明UMNSAH/DF-1細胞是永生化而沒有轉(zhuǎn)化。UMNSAH/DF-1細胞可作為病毒增殖、重組蛋白表達和重組病毒生產(chǎn)的基質(zhì)。

UMNSAH/DF-1細胞產(chǎn)品信息

細胞名稱：UMNSAH/DF-1，雞胚胎成纖維細胞

細胞別稱：UMNSAH-DF-1; UMNSAH-DF 1; UMNSAH-DF1; UMNSAH/DF#1; DF-1; DF1; Douglas Foster-1;雞胚胎成纖維細胞;UMNSAH/DF-1

種屬來源：雞;10日齡

組織來源：胚胎，自發(fā)永生化

生長特性：貼壁生長

細胞形態(tài)：成纖維細胞樣

致瘤性：No, in immunosuppressed mice. No, in semisolid medium.

保藏機構：ATCC; CRL-12203

培養(yǎng)基：DMEM+10%優(yōu)質(zhì)FBS+PS

培養(yǎng)條件：氣相：95%空氣+5%二氧化碳;溫度：38℃~40℃

凍存條件：無血清凍存液，液氮儲存

UMNSAH/DF-1細胞培養(yǎng)操作說明

細胞培養(yǎng)的基本條件

實驗室條件

1. 無菌環(huán)境：無菌室包括更衣室，緩沖間，風淋間，操作間

2. 儀器設備：超凈工作臺-操作平臺、CO2 培養(yǎng)箱-細胞生長的環(huán)境、倒置顯微鏡-觀察細胞、離心機-離心收集細胞、冰箱-放置培養(yǎng)基等試劑、水浴鍋-復蘇細胞、真空泵-收集廢液、滅菌鍋-滅菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-凍存細胞、純水儀-制備一級水

3. 器材耗材：玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、巴士管、離心管、移液槍、槍頭(白色 0-10ul;黃色 20-200ul;藍色 100-1000ul)、濾器，吸管，多孔培養(yǎng)皿、6cm 皿、10cm 皿，培養(yǎng)瓶等。

4. 試劑：DMEM基礎培養(yǎng)基、優(yōu)質(zhì)FBS胎牛血清、雙抗、胰酶、pbs

操作者工作范疇

1. 無菌操作：洗手，戴手套，穿實驗服，常噴 75%酒精

UMNSAH/DF-1細胞復蘇步驟

1.準備：紫外線照臺 30min，提前打開水浴鍋設置 37℃，培養(yǎng)基臨用前放水浴箱里溫育20 分鐘(或者放在超凈工作臺常溫放 30min)。在操作臺上擺放好物品，左邊放完全培養(yǎng)液，1mL 槍頭(已滅菌)，培養(yǎng)皿，右上角放廢液缸，1mL 移液槍，3mL 巴氏管。檢查離心機，廢液泵。

2)待水浴鍋溫度達到 37℃時，戴上手套和護目鏡，從-196℃液氮罐中取出凍存管，將含有1 mLUMNSAH/DF-1細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，同時不斷輕輕搖動凍存管，盡量保證凍存管內(nèi)細胞 1min 內(nèi)融化，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻，移入離心機中 100rpm 離心 3min，以 75%酒精噴凍存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。

3)用 3mL 巴氏管取 5mL 新鮮培養(yǎng)基到一個新的 6cm 培養(yǎng)皿中，(若離心后細胞量較多，可取 12mL 新鮮培養(yǎng)基到一個新的 10cm 培養(yǎng)皿中)，標記日期、所用培養(yǎng)基名稱和細胞名稱。

4)用廢液泵(吸力不要太大)取一個黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取 1mL 新鮮培養(yǎng)基重懸細胞后(充分混勻)，將細胞懸液加入到培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺上以畫“8”字法鋪勻UMNSAH/DF-1細胞(一般培養(yǎng)皿在臺子上畫 30 個 8 字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測是否鋪勻細胞。

5)確定細胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入 CO2 培養(yǎng)箱過夜。(盡量平直放入不要晃動)，第二天換液并檢查細胞密度。

UMNSAH/DF-1細胞傳代操作

1) 準備工作：紫外線照臺 30min，準備好細胞培養(yǎng)所需試劑物品：培養(yǎng)液，胰酶，PBS(試劑提前拿出 37℃預熱或者常溫放置半小時以上);傳代用培養(yǎng)皿，巴士管，離心管(已滅菌)，槍頭(已滅菌)，移液槍，廢液缸。檢查離心機，廢液泵;

2)從培養(yǎng)箱拿出UMNSAH/DF-1雞胚胎成纖維細胞，在顯微鏡下觀察細胞密度和細胞狀態(tài)，當細胞狀態(tài)良好，且密度達到 85%左右的時候即可進行傳代;

4)打開廢液泵，用廢液泵吸頭(吸力不要太大)取一個藍色槍頭吸走上清廢液，用巴士管取 4ml 不含鈣、鎂離子的1xPBS(6cm 皿)到細胞培養(yǎng)皿中(若是 10cm 皿則取 8ml 1xPBS)，輕輕晃動以清洗細胞表面1-2次;

5)用廢液泵吸走 PBS 廢液，加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)于培養(yǎng)瓶中，拿起培養(yǎng)皿輕輕轉(zhuǎn)動以便胰酶浸泡到每個細胞，消化 1-3min(根據(jù)細胞貼壁情況判斷，貼壁較牢的消化時間長一點或者放入 CO2 培養(yǎng)箱中消化幾分鐘)后，在顯微鏡下觀察細胞是否變圓變亮，一旦發(fā)現(xiàn)大量細胞胞質(zhì)回縮，細胞間隙增大，即將脫離培養(yǎng)皿底，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

6)用 1ml 移液槍輕柔吹打，保證培養(yǎng)皿底的每個角落都吹打到，邊緣處也不能忽略(吹打時盡量避免產(chǎn)生氣泡，因其對UMNSAH/DF-1有傷害;需輕柔吹打，用力吹打?qū)毎灿袀?，把培養(yǎng)瓶中所有細胞懸液用吸 1ml 移液槍移入無菌離心管中。

7)將裝有UMNSAH/DF-1雞胚胎成纖維細胞懸液的離心管放入離心機中(配平)，1000 轉(zhuǎn)離心 3-5min，用廢液泵取一個黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取 1-2mL 新鮮培養(yǎng)基重懸細胞后(充分混勻)，將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺上以畫“8”字法鋪勻細胞(一般培養(yǎng)皿在臺子上畫 30 個 8 字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測是否鋪勻細胞。

8) 確定細胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入 CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(盡量平直放入不要晃動)。第二天再觀察細胞密度。

UMNSAH/DF-1細胞凍存準備

1) 準備工作：紫外線照臺 30min，準備好細胞培養(yǎng)所需試劑物品：培養(yǎng)液，胰酶，PBS(試劑提前拿出 37℃預熱或者常溫放置半小時以上);傳代用培養(yǎng)皿，巴士管，離心管(已滅菌)，槍頭(已滅菌)，移液槍，廢液缸。檢查離心機，廢液泵;

2)從培養(yǎng)箱拿出UMNSAH/DF-1，在顯微鏡下觀察UMNSAH/DF-1細胞密度和細胞狀態(tài)，待細胞生長狀態(tài)良好且存活率高的狀態(tài)下，細胞密度達 80–90%時，可進行細胞凍存操作，以T25 瓶為例

UMNSAH/DF-1細胞凍存步驟

a.收集細胞及細胞培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶內(nèi)所有培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無菌離心管，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數(shù)。

b.根據(jù)細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液， 在細胞凍存管上貼上細胞標簽(細胞標簽上包含：細胞名稱、凍存日期、培養(yǎng)用的 培養(yǎng)基)。

c.將凍存管入庫到-80 度凍存盒里，放置 24 小時后，即可移入液氮中保存，標記好入庫位置和凍存日期。

UMNSAH/DF-1雞胚胎成纖維細胞培養(yǎng)小貼士

1. UMNSAH/DF-1細胞密度過高時會出現(xiàn)空泡，傳代后狀態(tài)可恢復；

2. DF-1細胞培養(yǎng)難度較高，溫度波動會導致細胞空泡增多；

3. DF-1細胞為38℃~40℃培養(yǎng)，最佳培養(yǎng)溫度為39℃，37℃培養(yǎng)會影響細胞狀態(tài)，建議提前準備專用培養(yǎng)箱；

4. 受溫度波動影響，收貨常見細胞空泡較多，穩(wěn)定培養(yǎng)后可恢復。

UMNSAH/DF-1雞胚胎成纖維細胞培養(yǎng)常見問題

1.UMNSAH/DF-1雞胚胎成纖維細胞收貨后很多空泡?

這是因為UMNSAH/DF-1細胞在發(fā)貨過程中，容易受到溫度波動影響，而導致的細胞空泡增多。當細胞受到外界環(huán)境因素影響如溫度時，細胞會發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應。細胞溫度降低時，細胞膜上磷脂分子的運動減慢，流動性降低，從而降低了細胞膜對物質(zhì)的通透性，鈣離子內(nèi)流，從而導致細胞質(zhì)中色素堆積，空泡形成。

處理方法

將收到的細胞正常傳代，觀察空泡是是否有減少，若空泡仍有很多，可增加傳代次數(shù)，一般正常傳代后這種情況就會有所好轉(zhuǎn)。

2.UMNSAH/DF-1雞胚胎成纖維細胞培養(yǎng)注意事項?

細胞培養(yǎng)的最佳溫度主要取決于細胞供體的體溫，此外也受到解刨部位體溫差異的影響。對于不同的動物細胞，所需要的培養(yǎng)溫度也有所不同，對于禽類動物細胞，最佳培養(yǎng)溫度為39℃，所以UMNSAH/DF-1細胞的最佳培養(yǎng)溫度也為39℃。37℃培養(yǎng)會影響細胞狀態(tài)，建議提前準備專用培養(yǎng)箱。

若我們在培養(yǎng)細胞過程中出現(xiàn)了空泡，也有可能是細胞凋亡或是營養(yǎng)不夠等原因，針對不同的情況需要采用不同的解決辦法。在實驗中，我們可以通過時刻關注細胞的狀態(tài)，及時換液，采用優(yōu)質(zhì)血清，保證細胞所需營養(yǎng)充足等，避免空泡的出現(xiàn)。

雞胚胎成纖維細胞文獻溯源

2007年始，迄今為止，關于雞胚胎成纖維細胞的文獻已有5篇。

在pubmed數(shù)據(jù)庫中用“UMNSAH/DF-1”搜索該關鍵詞，第一篇為2007年Jiyoung Park在Mol Cell Endocrinol.發(fā)表的“Glucocorticoids modulate NF-kappaB-dependent gene expression by up-regulating FKBP51 expression in Newcastle disease virus-infected chickens”。

文獻概述

FK506結(jié)合蛋白51(FKBP51，由FKBP5基因編碼)是一個共伴蛋白分子，與伴侶蛋白HSP90和糖皮質(zhì)激素受體(GR)在非活化的GR復合物中相互作用。FKBP51是糖皮質(zhì)激素作用的負調(diào)節(jié)因子，當激素與GR結(jié)合時，它被FK506結(jié)合蛋白52(FKBP52，由FKBP4基因編碼)取代，使GR復合物活化。

該研究發(fā)現(xiàn)，新城疫病毒(NDV)感染的雞的12個器官中FKBP51 mRNA的表達被強烈誘導。相比非感染對照組的雞，感染NDV的雞的器官中皮質(zhì)酮水平也升高了，大約是2倍至6.5倍。地塞米松處理重現(xiàn)了FKBP51 mRNA表達的誘導，表明糖皮質(zhì)激素在全身誘導FKBP51 mRNA表達中起到了作用。

在雞的UMNSAH/DF-1細胞中，核因子kappaB(NF-kappaB)以FKBP51依賴方式被激活。在UMNSAH/DF-1細胞中研究了三個NF-kappaB依賴的抗凋亡基因bcl-2，bcl-x和bfl-1 / A1的調(diào)節(jié)。地塞米松處理UMNSAH/DF-1細胞導致bcl-2的上調(diào)，bcl-x和bfl-1 / A1的下調(diào)。FKBP51的表達也導致bfl-1 / A1的下調(diào)，但對bcl-2和bcl-x無影響，這表明胰高血糖素-FKBP51-NF-kappaB信號通路參與了UMNSAH/DF-1細胞中bfl1/A1的表達調(diào)節(jié)。我們觀察到在NDV感染和地塞米松處理的雞的器官中，bcl-2，bcl-x和bfl-1/A1的表達顯示器官特異性的上調(diào)或下調(diào)。NDV感染和地塞米松處理對bfl-1/A1，bcl-2和bcl-x的差異調(diào)控表明其他因素參與了這些基因的調(diào)節(jié)。這些結(jié)果表明，NDV感染的雞中FKBP51的全身升高激活了NF-kappaB，該因子與其他因素合作以調(diào)節(jié)NF-kappaB依賴基因的表達。

UMNSAHDF-1雞胚胎成纖維細胞應用領域

雞胚胎成纖維細胞(UMNSAHDF-1) 是一種自發(fā)永生的雞細胞系。該細胞可用作病毒增殖(新城疫病毒、流感病毒、馬立克氏病病毒等)、重組蛋白表達(禽流感病毒H9N2等)和重組病毒生產(chǎn)的基質(zhì)，因此該細胞在疫苗開發(fā)中具有重要作用。此外，UMNSAH/DF-1細胞系也可作為重組蛋白表達系統(tǒng)，用于生產(chǎn)用于疫苗、診斷試劑或治療性蛋白的生物制品。

UMNSAH/DF-1 細胞系作為一種多功能和多用途的細胞模型，已被廣泛應用于多個研究領域。同時，由于UMNSAH/DF-1細胞系來源于雞，它們在評估藥物對家禽的潛在毒性方面具有獨特優(yōu)勢，可用于藥物篩選和毒理學研究。

在細胞凋亡和信號傳導研究中，UMNSAH/DF-1細胞系已被用于研究藥物或病毒感染引起的細胞凋亡過程，以及相關的信號傳導途徑，如NotcH1細胞和Δ-like-1的表達。UMNSAH/DF-1細胞系也是進行基因克隆、基因編輯(如CRISPR/Cas9技術)和基因表達研究的良好模型。

DF-1細胞系還可用于評估生物材料的生物相容性，以及它們對細胞附著、增殖和分化的影響。此外，UMNSAH/DF-1細胞系在癌癥研究、細胞衰老研究和神經(jīng)生物學研究中也有廣泛應用。