前言

永生化膠質(zhì)細(xì)胞株的建立對(duì)于研究神經(jīng)系統(tǒng)功能和疾病具有重要的意義和必要性。膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要支持細(xì)胞，它們?cè)诰S持神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能中起著關(guān)鍵作用，包括提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)、參與血腦屏障的形成和維護(hù)等。同時(shí)，膠質(zhì)細(xì)胞也是許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如腦腫瘤、阿爾茨海默病、帕金森病等)的重要參與者。

然而，由于神經(jīng)系統(tǒng)的復(fù)雜性和敏感性，直接獲取和研究活體人腦中的膠質(zhì)細(xì)胞一直是一個(gè)挑戰(zhàn)。因此，科學(xué)家們通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，建立了永生化膠質(zhì)細(xì)胞株，這些細(xì)胞可以在實(shí)驗(yàn)室條件下無(wú)限期地生長(zhǎng)和繁殖，為研究提供了便利。

通過(guò)永生化膠質(zhì)細(xì)胞株，科學(xué)家們可以更深入地了解膠質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)特性、功能機(jī)制以及其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用，從而為疾病的預(yù)防和治療提供新的靶點(diǎn)和策略。例如，通過(guò)對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞的研究，科學(xué)家們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些與神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的基因和信號(hào)通路，這為疾病的診斷和治療提供了新的思路。

今日推薦

今天推薦的是由南里奧格蘭德聯(lián)邦大學(xué)在2019年8月17日發(fā)表于Neurochemistry International(2021IF：4.1998，JCRQ1)的一篇文章，通訊作者是Marina Concli Leite教授，研究主要闡述了星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)模型：原代培養(yǎng)、永生化星形膠質(zhì)細(xì)胞和C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的分子和功能表征。

研究背景

人們對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的生理學(xué)及其在大腦功能中作用的認(rèn)識(shí)在不斷進(jìn)步。原代星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)是在一個(gè)孤立的系統(tǒng)中研究這些細(xì)胞的另一種方法：研究它們的生理和病理狀態(tài)。細(xì)胞系通常被用作星形膠質(zhì)細(xì)胞模型，因?yàn)樗鼈兏菀撞僮鳎俣雀?，成本更低。然而，?duì)這些細(xì)胞的不同特征進(jìn)行評(píng)估的研究很少，這可能會(huì)對(duì)使用它們作為星形膠質(zhì)細(xì)胞模型的有效性產(chǎn)生疑問(wèn)。

摘要部分

本研究的目的是比較原代培養(yǎng)物(PC)與兩種細(xì)胞系—永生化星形膠質(zhì)細(xì)胞和C6細(xì)胞—在蛋白質(zhì)表征、形態(tài)和代謝功能活性方面的差異。研究人員的結(jié)果表明，在相同的培養(yǎng)條件下，永生化星形膠質(zhì)細(xì)胞和C6細(xì)胞的分化星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(如GFAP、S100B、AQP4和ALDH1L1)均呈陽(yáng)性，但表達(dá)量低于原代星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物。增殖細(xì)胞的谷氨酸代謝和細(xì)胞通訊能力降低。然而，與原代星形膠質(zhì)細(xì)胞相比，C6系細(xì)胞的葡萄糖攝取量升高，這可能是由于它們的腫瘤來(lái)源和高增殖率造成的。永生化星形膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)速度低于C6細(xì)胞，其基底形態(tài)與原代星形膠質(zhì)細(xì)胞相似。然而，事實(shí)證明它們并不是某些經(jīng)典星形膠質(zhì)細(xì)胞功能(如S100B分泌和GFAP含量)的良好繁殖模型，尤其是在受到刺激時(shí)。相比之下，C6細(xì)胞對(duì)刺激的反應(yīng)結(jié)果與原發(fā)性星形膠質(zhì)細(xì)胞相似。在此，研究人員對(duì)三種星形膠質(zhì)細(xì)胞模型進(jìn)行了功能比較，試圖選擇最適合研究星形膠質(zhì)細(xì)胞的模型，優(yōu)化這一知識(shí)領(lǐng)域的研究。

材料方法

1. PC、C6和IA的形態(tài)學(xué)評(píng)估、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物的蛋白質(zhì)圖譜、細(xì)胞中的谷氨酸代謝、細(xì)胞中的葡萄糖代謝、縫隙連接通信。

用肌動(dòng)蛋白、GFAP和S100B蛋白標(biāo)記對(duì)細(xì)胞星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行了評(píng)估(圖1)。

圖1.PC、C6和IA的形態(tài)學(xué)評(píng)估

PC和IA表現(xiàn)出相似的多邊形，細(xì)胞進(jìn)程較少。肌動(dòng)蛋白標(biāo)記顯示這兩種細(xì)胞都有有組織的細(xì)絲。相比之下，C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞呈細(xì)長(zhǎng)體，肌動(dòng)蛋白纖維彌散。與IA不同，PC和C6在10 μM福斯克林的刺激下出現(xiàn)了形態(tài)學(xué)改變。PC表現(xiàn)出星狀特征，C6則表現(xiàn)出細(xì)胞體回縮，并伴有細(xì)長(zhǎng)的突起。眾所周知，發(fā)育過(guò)程中GFAP/波形蛋白比值的增加與星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化有關(guān)。在研究人員的研究中，IA和C6的GFAP/波形蛋白比率與PC相同，表明其分化狀態(tài)相似(圖2A)。在星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物方面，C6和IA呈陽(yáng)性，但與PC相比，GFAP、S100B、ALDHL1和AQP4的水平有所降低(圖2A、B、D和E)。有趣的是，Kir4.1在所有測(cè)試的細(xì)胞模型中都顯示出相似的水平(圖2F)。谷氨酸代謝是通過(guò)測(cè)量谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(EAAT1和EAAT2)的含量以及GS活性和谷氨酸攝取量來(lái)評(píng)估的。

圖2.PC、IA和C6中星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物的蛋白質(zhì)圖譜

所有這些指標(biāo)在IA和C6細(xì)胞中都有所降低(圖3A-E)。有趣的是，PC、IA和C6細(xì)胞產(chǎn)生的GSH含量相當(dāng)，而GSH是星形膠質(zhì)細(xì)胞中的主要抗氧化劑，其生物合成也取決于谷氨酸含量(圖3F)。葡萄糖代謝是通過(guò)測(cè)量葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體和攝取來(lái)評(píng)估的。

圖3.PC、IA和C6細(xì)胞中的谷氨酸代謝

在這些分析中，C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的葡萄糖攝取率高于PC和IA(圖4A)。盡管如此，與PC相比，IA和C6的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(GLUT-1)含量水平較低(圖4B)。星形膠質(zhì)細(xì)胞的交流對(duì)其許多功能至關(guān)重要。

圖4.PC、IA和C6細(xì)胞中的葡萄糖代謝

通過(guò)分析星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)最豐富的連接蛋白--連接蛋白-43的含量以及使用熒光黃染料進(jìn)行的廢料負(fù)載試驗(yàn)，對(duì)這種通訊進(jìn)行了評(píng)估。這兩項(xiàng)分析表明，與PC細(xì)胞相比，IA和C6細(xì)胞的間隙連接通訊受損(圖5A和B)?？紤]到三種模型的星形膠質(zhì)細(xì)胞在基礎(chǔ)蛋白譜方面存在差異，研究人員想知道它們?cè)谙嗤拇碳は率欠駮?huì)有不同的反應(yīng)。研究人員使用了描述良好的刺激來(lái)干擾星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能。在葡萄糖和谷氨酸攝取以及TNFα分泌的刺激下，三種細(xì)胞模型的反應(yīng)相似。然而，在S100B分泌、GS活性和GSH含量方面，IA不受刺激影響，這與PC和C6的反應(yīng)相似。有趣的是，在PC中觀察到的LPS刺激下GFAP的增加在IA和C6中都沒(méi)有顯示出來(lái)。根據(jù)MTT還原試驗(yàn)，在所有刺激下細(xì)胞的活力都沒(méi)有受到影響。

圖5.PC、IA和C6中的縫隙連接通信

研究結(jié)論：PC、C6和IA的形態(tài)學(xué)評(píng)估、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物的蛋白質(zhì)圖譜、細(xì)胞中的谷氨酸代謝、細(xì)胞中的葡萄糖代謝、縫隙連接通信。

結(jié)論與討論

星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)和可塑性可能是調(diào)節(jié)細(xì)胞外微環(huán)境和突觸活動(dòng)的關(guān)鍵。在本研究中，基礎(chǔ)條件下的形態(tài)學(xué)評(píng)估顯示PC和IA具有相似的多邊形。相比之下，C6細(xì)胞顯示出紡錘形或三角形的細(xì)胞體和不規(guī)則的肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)，這與膠質(zhì)瘤的侵襲性有關(guān)。雖然在研究人員的研究中使用了高通量的C6細(xì)胞，但這些細(xì)胞來(lái)源于腫瘤，可能保留了轉(zhuǎn)化細(xì)胞的某些特征。

在通常會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)cAMP含量增加的福斯可林刺激下，PC如預(yù)期一樣表現(xiàn)出細(xì)胞體回縮和突出的長(zhǎng)突起。在相同條件下，C6表現(xiàn)出細(xì)胞體回縮，但與PC相比，C6的突起稀疏且較細(xì)。盡管IA在形態(tài)上與PC相似，但它們不受福斯可林刺激的影響。有趣的是，原代星形膠質(zhì)細(xì)胞在亞培養(yǎng)后會(huì)失去突觸，這可能是內(nèi)臟無(wú)反應(yīng)的部分原因。與研究人員的研究結(jié)果類(lèi)似，二丁烯酰-CAMP在永生細(xì)胞系中也不會(huì)像在C6和PC中那樣誘導(dǎo)GFAP上調(diào)。此外，星形膠質(zhì)細(xì)胞肥大高度依賴(lài)于GFAP含量，而GFAP含量在系細(xì)胞中已被證明會(huì)減少，本研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。總之，研究人員的結(jié)果表明，IA的形態(tài)可塑性可能會(huì)受到影響，因此該細(xì)胞系不適合作為評(píng)估模型。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是功能性和分子異質(zhì)性細(xì)胞。不過(guò)，它們有一些蛋白質(zhì)標(biāo)記，如S100B和GFAP。C6和IA對(duì)這兩種標(biāo)記物均呈陽(yáng)性，但數(shù)量明顯少于PC。以前在其他研究中也觀察到類(lèi)似的結(jié)果。除了這些標(biāo)記物，研究人員還評(píng)估了ALDH1L1蛋白，它已被用作一種新的星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物。雖然這種蛋白參與葉酸代謝，干擾細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)，但與PC細(xì)胞相比，IA和C6細(xì)胞的ALDH1L1水平有所降低。在星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上廣泛表達(dá)的AQP4水平也出現(xiàn)了同樣的結(jié)果。

IA和C6細(xì)胞中重要星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物水平的降低可能是由于它們的高增殖性。從這個(gè)意義上說(shuō)，這兩種細(xì)胞系可能更多地合成與細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白質(zhì)，而不是特定的星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物。眾所周知，細(xì)胞內(nèi)任何特定蛋白質(zhì)的水平都是動(dòng)態(tài)的?；虮磉_(dá)可能隨細(xì)胞密度或細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換時(shí)間而變化。例如，在匯合細(xì)胞中，與增殖相關(guān)的基因會(huì)減少，或者與細(xì)胞分化相關(guān)的基因會(huì)上調(diào)。增殖能力的減弱可能會(huì)使細(xì)胞處于更加分化的狀態(tài)。因此，在本分析以及其他使用這些細(xì)胞模型的研究中，保持匯合模式以達(dá)到基因表達(dá)的穩(wěn)定性非常重要。

有趣的是，Kir4.1通道也是一種神經(jīng)膠質(zhì)特異性蛋白，在所有測(cè)試的細(xì)胞類(lèi)型中都顯示出相似的含量。然而，在膠質(zhì)瘤中，鉀傳導(dǎo)已被證明因細(xì)胞核膜定位而非細(xì)胞膜定位而受損。因此，相似的蛋白表達(dá)并不一定代表Kir4.1的功能。

星形膠質(zhì)細(xì)胞中的谷氨酸代謝受損可能會(huì)影響谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)和許多大腦功能，這在神經(jīng)退行性疾病中也能看到。最近的研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)谷氨酸的攝取取決于GS的活性，而GS的活性可確保有效清除EAATs捕獲的谷氨酸。因此，研究人員的分析沒(méi)有像早期研究那樣只觀察表達(dá)，而是評(píng)估了這種清除機(jī)制的功能。研究人員發(fā)現(xiàn)，與PC細(xì)胞相比，IA和C6細(xì)胞中的谷氨酸代謝減少。雖然谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在細(xì)胞系中的基礎(chǔ)表達(dá)與PC差別不大，但其功能卻極低，這表明在這些細(xì)胞中，EAAT1和EAAT2在質(zhì)膜中的位置可能很差。值得注意的是，其他研究沒(méi)有在系細(xì)胞中檢測(cè)到谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，但這是在C6低傳代細(xì)胞中進(jìn)行的分析，與研究人員的細(xì)胞不同，研究人員的細(xì)胞至少經(jīng)過(guò)了100次亞培養(yǎng)。C6從膠質(zhì)瘤模型轉(zhuǎn)變?yōu)榉只切文z質(zhì)細(xì)胞模型的機(jī)理尚不清楚。有趣的是，在谷氨酸刺激下，EAAT2的過(guò)表達(dá)會(huì)降低C6細(xì)胞的增殖率，這表明谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體與細(xì)胞增殖之間存在負(fù)相關(guān)。

GSH的產(chǎn)生使星形膠質(zhì)細(xì)胞在大腦中具有很強(qiáng)的氧化防御能力，所有測(cè)試的細(xì)胞類(lèi)型都顯示出相似的GSH含量。眾所周知，GSH的產(chǎn)生取決于谷氨酸的含量?？紤]到IA和C6細(xì)胞的谷氨酸攝取量和GS活性均低于PC，研究人員可以認(rèn)為谷氨酸在這些細(xì)胞系中主要用于產(chǎn)生GSH。因此，這些途徑在PC、IA和C6細(xì)胞中可能受到不同的控制。與此觀點(diǎn)相印證的是，與正常星形膠質(zhì)細(xì)胞相比，Xc-半胱氨酸/谷氨酸拮抗劑系統(tǒng)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)，從而促進(jìn)了它們的生長(zhǎng)、存活和擴(kuò)增。此外，高GSH的產(chǎn)生可保護(hù)膠質(zhì)瘤細(xì)胞免受增殖細(xì)胞高氧化代謝的影響。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是大腦能量平衡的關(guān)鍵因素。星形膠質(zhì)細(xì)胞捕獲的大部分葡萄糖都被輸送到糖原儲(chǔ)存庫(kù)和/或轉(zhuǎn)化為乳酸供神經(jīng)元輸出。雖然與PC細(xì)胞相比，星形膠質(zhì)細(xì)胞中的主要葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(GLUT-1)在IA和C6細(xì)胞中表達(dá)不足，但C6細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取更為明顯(圖4)。眾所周知，腫瘤衍生細(xì)胞存在沃伯格效應(yīng)，即糖酵解是主要的能量生成方式。因此，它們比正常細(xì)胞消耗更多的葡萄糖。因此，之前的一項(xiàng)研究表明，與正常星形膠質(zhì)細(xì)胞相比，C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞利用更多的葡萄糖，產(chǎn)生更少的乳酸。有研究認(rèn)為，葡萄糖可能被用于另一條途徑，如磷酸戊糖分流，這增加了谷胱甘肽還原酶活性產(chǎn)生的NADPH和GSH含量。因此，能量代謝的增加在增殖細(xì)胞中很常見(jiàn)。

葡萄糖等代謝底物可穿過(guò)星形膠質(zhì)細(xì)胞間隙連接，這種溝通與增殖速度成反比。腫瘤細(xì)胞系通常不存在間隙連接，其存在會(huì)受到腫瘤促進(jìn)分子的抑制。事實(shí)上，眾所周知C6的細(xì)胞通訊水平很低，這與研究人員的研究結(jié)果和之前的研究中看到的Cx43的低表達(dá)是一致的。有趣的是，間隙連接通訊的增加會(huì)降低C6細(xì)胞的葡萄糖攝取量和增殖率。同時(shí)，內(nèi)皮素對(duì)間隙連接的抑制會(huì)刺激GLUT-1從細(xì)胞內(nèi)池內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到星形膠質(zhì)細(xì)胞的質(zhì)膜并上調(diào)。因此，除了沃伯格效應(yīng)，間隙連接也可能在增殖細(xì)胞的葡萄糖攝取調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。

當(dāng)不同的星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)模型接受相同的處理時(shí)，文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)了一些相互矛盾的結(jié)果。這些不同的結(jié)果給分析帶來(lái)了困難，并對(duì)模型的有效性產(chǎn)生了懷疑。因此，研究人員測(cè)試了三種不同的星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)模型對(duì)相同處理的反應(yīng)。為此，研究人員使用了文獻(xiàn)中已知的能引起原代培養(yǎng)物功能變化的刺激物。值得一提的是，培養(yǎng)反應(yīng)的變化也可能受到培養(yǎng)程序差異的影響，如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)板涂層和體外培養(yǎng)天數(shù)。這些差異可能會(huì)干擾基因表達(dá)和形態(tài)變化。事實(shí)上，最近的研究表明細(xì)胞外基質(zhì)的組成決定了星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)機(jī)械和炎癥刺激的反應(yīng)。在這項(xiàng)工作中，研究人員對(duì)所有三種培養(yǎng)模型采用了相同的程序，以確保觀察到的處理效果是由于生物細(xì)胞的變異造成的?？傮w而言，研究人員的研究結(jié)果表明，PC和C6細(xì)胞對(duì)相同刺激的反應(yīng)相似，特別是在S100B分泌、GSH含量、谷氨酰胺合成酶活性、葡萄糖和谷氨酸攝取以及TNFα分泌方面。因此，雖然它們的基礎(chǔ)蛋白量往往不同，但這些途徑的激活似乎是相似的，至少對(duì)測(cè)試的刺激是如此。相比之下，IA的反應(yīng)性較低，表明這種轉(zhuǎn)染克隆不是研究星形膠質(zhì)細(xì)胞某些特征的良好模型。最近的研究表明，在不同傳代中表達(dá)的p53同工酶調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)退行性變。因此，具有p53抑制作用的IA(由于轉(zhuǎn)染過(guò)程)可能會(huì)影響其功能。值得注意的是，IA保留了對(duì)谷氨酸和葡萄糖攝取的反應(yīng)，以及TNF α的分泌。

根據(jù)研究人員的數(shù)據(jù)，雖然PC技術(shù)耗時(shí)較長(zhǎng)、成本較高，但將其用作星形膠質(zhì)細(xì)胞研究的繁殖模型無(wú)疑是首選。不過(guò)，C6細(xì)胞系雖然有一定的局限性，但似乎也能在很大程度上再現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞?？傊?，這項(xiàng)工作確定了每種培養(yǎng)類(lèi)型的局限性和優(yōu)勢(shì)，對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能進(jìn)行了全面綜合的比較，優(yōu)化了這一知識(shí)領(lǐng)域的研究。此外，該研究還強(qiáng)調(diào)了針對(duì)每種相關(guān)刺激驗(yàn)證細(xì)胞培養(yǎng)模型的重要性，以便在無(wú)法使用PC時(shí)選擇合適的細(xì)胞模型。