背景簡(jiǎn)介

NK細(xì)胞又稱自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK細(xì)胞)，NK細(xì)胞形態(tài)上屬于大顆粒淋巴細(xì)胞，來(lái)源于骨髓，是除T細(xì)胞、B細(xì)胞之外的第三大類淋巴細(xì)胞，約占血液中所有免疫細(xì)胞(白細(xì)胞數(shù)量)的15%，屬于天然免疫系統(tǒng)的核心細(xì)胞。

NK細(xì)胞存在于大多數(shù)器官(骨髓、肺、淋巴結(jié)、外周血、脾臟和肝臟)。NK細(xì)胞也被描述在許多其他器官中，如腸、皮膚、膀胱、扁桃體、子宮、胸腺、腎臟、胰腺、脂肪組織，甚至在小鼠大腦中。

細(xì)胞形態(tài)

細(xì)胞特點(diǎn)

1. 免疫監(jiān)視

NK免疫細(xì)胞能高度識(shí)別、監(jiān)視體內(nèi)細(xì)胞病變，防止超敏反應(yīng)，執(zhí)行免疫監(jiān)視。

2. 清除病原體

防止鄰近的神經(jīng)元相互干擾，且參與形成血—腦屏障，對(duì)物質(zhì)的運(yùn)輸有一定選擇作用。

3. 抗衰老

免疫細(xì)胞可誘導(dǎo)老細(xì)胞凋亡，促進(jìn)信息報(bào)產(chǎn)生，提升精力、體力、延緩衰老。

4. 殺傷腫瘤細(xì)胞

NK 細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，可靶向性殺傷腫瘤細(xì)胞，是未來(lái)治療腫瘤的體細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)介紹

本實(shí)驗(yàn)室采用獨(dú)有的細(xì)胞因子培養(yǎng)法，將外周血中的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)。經(jīng)過(guò)14天的誘導(dǎo)培養(yǎng)CD3-/CD56+NK細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量可擴(kuò)增達(dá)到1000倍，其純度可達(dá)80%以上

材料準(zhǔn)備

儀器：離心機(jī)、顯微鏡、計(jì)數(shù)器、水浴鍋、恒溫培養(yǎng)箱。

試劑：人外周血淋巴細(xì)胞分離液、清洗液、NK細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、NK-A、NK-B、NK-C、NK-D、NK-E。

耗材：10 mL移液管、15 mL離心管、采血管、T75培養(yǎng)瓶、T175培養(yǎng)瓶。

操作步驟

提前開(kāi)啟紫外線照射超鏡臺(tái)30分鐘，超鏡臺(tái)通風(fēng)10分鐘以上，水浴鍋提前開(kāi)啟加熱至56℃，提前準(zhǔn)備好移液管、T75培養(yǎng)瓶、人外周血淋巴細(xì)胞分離液、清洗液、NK細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、因子、1 mL槍頭、200 μL槍頭、移液槍、15 mL離心管，提前從冰箱取出放置室溫。

(一)單個(gè)核細(xì)胞分離

血液樣本量為10 mL，取兩支15 mL離心管各加入5 mL分離(液與血液體積相同)用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，500轉(zhuǎn)離心20分鐘(分離PBMC時(shí)離心轉(zhuǎn)速設(shè)置為慢升慢降，升為9，降調(diào)為0)離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為4層，第一層為血漿層，第二層為環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層，第三層為透明分離液層，第四層為紅細(xì)胞層。收集血漿到新的離心管中血漿56℃30分鐘滅活900轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清置于4℃保存，用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色單個(gè)和細(xì)胞層到另一個(gè)50 mL離心管中，向所得離心管中加入10 mL清洗液混勻細(xì)胞，300轉(zhuǎn)離心10分鐘，棄上清用吸管以10 mL清洗液重懸所得細(xì)胞300轉(zhuǎn)離心10分鐘，之后重復(fù)進(jìn)行清洗步驟。棄上清后以0.5 mL后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。

(二)NK細(xì)胞培養(yǎng)

D0天：約用10 mL NK基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基加入因子NK-A、NK-B、NK-C、NK-D和5%自體血漿將制備好的單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)重懸，按細(xì)胞密度1.0-2.0M cells/mL鋪于T-75瓶中搖晃混勻后做好標(biāo)記，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

D4天：補(bǔ)加10 mL培養(yǎng)基(含因子NK-A、NK-B、NK-C、NK-D和5%自體血漿)此時(shí)瓶子含20 mL培養(yǎng)基做好標(biāo)記后放,入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

D6天：補(bǔ)加20毫升培養(yǎng)基(含因子NK-A、NK-B、NK-C、NK-D和5%自體血漿)此時(shí)瓶里含有40 mL培養(yǎng)基做好標(biāo)記后,放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

D8天：往培養(yǎng)瓶補(bǔ)加40 mL培養(yǎng)基(含因子NK-A、NK-B、NK-C、NK-D和1%自體血漿)同時(shí)加入因子NK-E將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至T175瓶中，此時(shí)瓶子含80mL培養(yǎng)液做好標(biāo)記后，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

D10天：往培養(yǎng)瓶補(bǔ)加80 mL培養(yǎng)基(含因子NK-A、NK-B、NK-C、NK-D、NK-E和1%自體血漿)此時(shí)瓶子含160 mL培養(yǎng)液做好標(biāo)記后，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

D12天：往培養(yǎng)瓶補(bǔ)加160 mL培養(yǎng)基(含因子NK-A、NK-B、NK-C、NK-D、NK-E和1%自體血漿)此時(shí)瓶子含320 mL培養(yǎng)液，將培養(yǎng)液分至另一個(gè)培養(yǎng)瓶中做好標(biāo)記后，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

D14天到15天:收獲目的細(xì)胞

NK細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)

采血環(huán)節(jié)注意事項(xiàng)

1. 因?yàn)镋DTA會(huì)影響免疫細(xì)胞的激活與擴(kuò)增，采集血樣時(shí)禁止使用 EDTA 抗凝的真空采樣管。

2. 采血管選擇：肝素鈉采血管>枸櫞酸鈉采血管

3. 暫存：4度

血漿

1. 自體血漿滅活前可以加入8%葡萄糖酸鈣注射液，減少血漿凝固、血漿添加后細(xì)胞出絮等問(wèn)題。

2. 滅活后的自體血漿在4℃冰箱保存即可，請(qǐng)?jiān)谝粋€(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)使用完畢。

3. 培養(yǎng)中后期自體血漿不足時(shí)，可以選用AB血漿

4. 不建議使用人血清白蛋白替代，其中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較少，效果較差

血小板、紅細(xì)胞混入問(wèn)題

1. 部分外周血在提取PBMC的過(guò)程中，白膜層可能會(huì)存在一些紅細(xì)胞，吸取時(shí)應(yīng)盡可能避開(kāi)有紅細(xì)胞部分。

2. 若不易區(qū)分，則接種PBMC應(yīng)稍加大接種量。

3. 不建議加入紅細(xì)胞裂解液等，對(duì)免疫細(xì)胞的活性、增殖能力存在較大影響。

培養(yǎng)基配制及補(bǔ)液

1. 每次補(bǔ)液時(shí)添加的培養(yǎng)基需預(yù)溫，用多少取多少，禁止將整瓶培養(yǎng)基預(yù)溫、禁止反復(fù)預(yù)溫。

2. 培養(yǎng)基現(xiàn)配現(xiàn)用，配成完全培養(yǎng)基后4°保存。

1. 使用經(jīng)過(guò)TC處理的細(xì)胞培養(yǎng)瓶。

2. 盡可能使用大體積的培養(yǎng)袋，促進(jìn)細(xì)胞間的氣體交換，防止代謝廢物過(guò)多影響細(xì)胞增殖。

3. 如采用1L培養(yǎng)體系，推薦使用2L培養(yǎng)袋;采用2L培養(yǎng)體系，推薦每個(gè)1L體系使用1.8L培養(yǎng)袋。

4. 剛?cè)氪鼤r(shí)，一般細(xì)胞培養(yǎng)袋大而細(xì)胞液體積小，建議將培養(yǎng)袋對(duì)折使用(d7)，選擇合適的底面積培養(yǎng)。

5. 接種密度：外周血的推薦接種密度為1.5-2E6cells/mL;

1. 細(xì)胞接種后，第1-3天會(huì)形成懸浮細(xì)胞小團(tuán)，第3-5天絕大部分懸浮細(xì)胞團(tuán)貼壁，不可將其晃起，第5-7天貼壁的細(xì)胞團(tuán)變大、變多，這些都是正常的細(xì)胞形態(tài)。

2. 培養(yǎng)前期一定不要吹打細(xì)胞團(tuán)(D0-D5)，以減少細(xì)胞機(jī)械損傷。

NK細(xì)胞鑒定

NK細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)問(wèn)題解答

1.問(wèn)：NK細(xì)胞成團(tuán)分布，如果不吹打細(xì)胞團(tuán)，會(huì)引起細(xì)胞老化嗎?

1.答：NK細(xì)胞成團(tuán)分布是一種非常正常的細(xì)胞形態(tài)，不吹打不會(huì)引起細(xì)胞老化。如果細(xì)胞團(tuán)過(guò)大，可以在鏡下觀察，如果細(xì)胞團(tuán)內(nèi)部呈現(xiàn)一種透亮的狀態(tài)，說(shuō)明團(tuán)塊內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)很充足。如果團(tuán)塊呈現(xiàn)出漆黑的狀態(tài)，此時(shí)可以適當(dāng)考慮把細(xì)胞團(tuán)塊吹散。

2.問(wèn)：分離單個(gè)核細(xì)胞時(shí)，紅細(xì)胞摻雜比較多，怎么改善?

2.答：分離時(shí)有時(shí)會(huì)存在紅細(xì)胞摻雜比較多的問(wèn)題，紅細(xì)胞會(huì)在5～7天時(shí)皺縮凋亡，但是它會(huì)影響單個(gè)核細(xì)胞的計(jì)數(shù)。

一般有兩個(gè)處理方案：(1)對(duì)樣本下層紅色液體，按照1:2的比例采用緩沖液進(jìn)行稀釋;(2)取少部分細(xì)胞懸液，做紅細(xì)胞裂解，從而達(dá)到對(duì)單個(gè)核細(xì)胞精確計(jì)數(shù)的目的。

3.問(wèn)：PBMC里的NK細(xì)胞凍存復(fù)蘇后為還能繼續(xù)擴(kuò)增嗎?

3.答：免疫類細(xì)胞的復(fù)蘇靜默期較長(zhǎng)，一次凍存對(duì)于細(xì)胞質(zhì)量的影響非常大。培養(yǎng)完成的NK量非常大，經(jīng)過(guò)凍存后較難恢復(fù)到新鮮效果，成體NK細(xì)胞一般是直接用于臨床。

4.問(wèn)：換瓶或轉(zhuǎn)袋時(shí)，舊培養(yǎng)瓶中殘留細(xì)胞如何處理?

4.答：當(dāng)培養(yǎng)體積不斷擴(kuò)大后，需要進(jìn)行換瓶或轉(zhuǎn)袋處理。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新容器后，原培養(yǎng)瓶在顯微鏡下觀察通常能看到瓶壁上仍附有較多細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)，可在原培養(yǎng)瓶中添加適當(dāng)新鮮培養(yǎng)基(無(wú)需添加血漿)，繼續(xù)培養(yǎng)1-2天后可觀察到大量細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)已懸浮在培養(yǎng)液中，此時(shí)可將這些細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移合并回到正常體系培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)袋中。舊培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)1-2天后仍無(wú)法脫落的細(xì)胞直接丟棄。

NK細(xì)胞的應(yīng)用

預(yù)防腫瘤

1. NK細(xì)胞的活力和功效隨著年齡的增長(zhǎng)逐漸降低

2. 隨著年齡的增長(zhǎng)，人體免疫力逐漸減弱，腫瘤發(fā)病率逐年提高。

3. NK細(xì)胞是免疫細(xì)胞的一種，被醫(yī)學(xué)界公認(rèn)為“抗癌第一道防線”

4. NK細(xì)胞可以通過(guò)釋放穿孔素、顆粒酶、抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用直接殺傷腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常的細(xì)胞沒(méi)有任何傷害。

抗衰老

1. NK免疫細(xì)胞不僅可以清除癌變、病變細(xì)胞，還具有清除衰老細(xì)胞、病毒和自由基的功效。

2. NK細(xì)胞能夠提升人體免疫力，抵抗衰老，改善睡眠，全面改善新陳代謝功能。

預(yù)防乙肝病毒

NK細(xì)胞治療可以直接清除HBV,還可以清除被病毒感染的肝細(xì)胞。通過(guò)定期回輸激活后的NK免疫細(xì)胞，進(jìn)行NK細(xì)胞抗病毒，可以預(yù)防病毒性肝炎進(jìn)一步惡化成肝硬化和肝癌。

保護(hù)呼吸系統(tǒng)

NK免疫細(xì)胞能顯著減輕肺部的炎性反應(yīng)，清除肺部病變的細(xì)胞，為根本性預(yù)防肺部疾病帶來(lái)了希望。

預(yù)防生殖系統(tǒng)炎癥

NK免疫細(xì)胞在修復(fù)全身各器官衰老的同時(shí)，能顯著地修復(fù)生殖系統(tǒng)的衰老退化，恢復(fù)和加強(qiáng)男性和女性性功能。

恢復(fù)皮膚彈性，再現(xiàn)青春容顏

NK細(xì)胞通過(guò)清理衰老細(xì)胞、促進(jìn)新陳代謝，具有顯著的美容美膚和美發(fā)效果。NK細(xì)胞能使松弛下垂的皮膚光滑收緊，恢復(fù)皮膚彈性，減少皮膚皺紋和色素沉著。

NK細(xì)胞療法臨床試驗(yàn)

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球 NK 相關(guān)的細(xì)胞療法臨床試驗(yàn)數(shù)量達(dá) 283 個(gè)。