H9細胞背景簡介

H9(別名WA09)人胚胎干細胞，1998年由美國干細胞學家詹姆斯·湯姆森博士建立，取自早期胚胎內(nèi)細胞團。細胞在培養(yǎng)時呈克隆狀，貼壁生長。該細胞不需要飼養(yǎng)層細胞支持，用干細胞專用Matrigel基質(zhì)膠包被培養(yǎng)器皿即可。

hESC(H9)細胞株來源于人胚胎干細胞，貼壁生長，呈克隆狀，可在hESC/iPSC完全培養(yǎng)基中快速增殖，而邊緣分化的細胞則在該培養(yǎng)基中生長較慢，從而選擇性擴增并獲得高純度人多能干細胞。

H9人胚胎干細胞特征

H9人胚胎干細胞系是國際上最通用胚胎干細胞系之一，該細胞是從人類早期胚胎內(nèi)細胞團分離出來，具有體外培養(yǎng)無限增殖、自我更新和多向分化的特性?？蔀榧毎z傳發(fā)育以及疾病模型研究提供豐富的實驗材料。

H9人胚胎干細胞形態(tài)

H9人胚胎干細胞熒光檢測

H9人胚胎干細胞培養(yǎng)狀態(tài)及操作步驟

一.試劑準備

1)hESC/iPSC完全培養(yǎng)基配制(500 mL)

1. 在4℃條件下解凍hESC/iPSC Grouth Supplements A/B，勿在37℃培養(yǎng)箱/水浴鍋解凍。

2. 參考表1在生物安全柜中，使用無菌移液管混勻下列成分配制成hESC/iPSC完全培養(yǎng)基，之后置于4℃儲存，封口膜封好后2周內(nèi)使用。

3. 有初培養(yǎng)需擴建的需求，建議先配置100 mL,保證2周內(nèi)使用完畢。

2)Matrigel鋪板(以貨號為354277的Corning? Matrigel?包被6孔板為例)

A. 分裝 Matrigel

1. 貨號354277的Matrigel，操作說明中不標注蛋白濃度，而是以Dilution Factor表示，如某批次的推薦Dilution Factor為278 μL，則表明278 μL可包被4塊6孔板，分裝數(shù)量=5 mL /0.278=17.98。

2. 準備18個無菌1.5 mL EP管，標記Matrigel日期、操作人;1mL無菌吸頭;EP管架，均置于-20℃冰箱中預(yù)冷1小時。

3. 將Matrigel放置4℃冰箱過夜解凍，當Matrigel完全解凍即可開始分裝。

注：在解凍時，將Matrigel放置冰箱內(nèi)側(cè)角落，切勿放在靠近冰箱門附近。

4. 準備一個裝滿碎冰的冰盒，將解凍過的Matrigel、預(yù)冷的1.5 mL EP管及EP管架、1mL吸頭放置于生物安全柜上。

5. 混勻Matrigel，無菌分裝于各個1.5 mL EP管中，并置于冰上。當吸頭被堵塞可能導(dǎo)致分裝體積不準時需要更換吸頭。

6. 將分裝后的 Matrigel 置于-20℃冰箱中保存。

B. 鋪板

1. 取36 mL冷藏DMEM/F12于50 mL離心管中，準備4個6孔板，標記Matrigel、批號、日期和操作人。

2. 1 mL無菌吸頭置于-20℃冰箱中預(yù)冷1小時，取出一支冷凍的Matrigel(5mL)置于4℃冰箱解凍至完全化凍。

3. 準備一個裝滿碎冰的冰盒，將解凍過的Matrigel、預(yù)冷的1mL吸頭放置于生物安全柜上。

4. 用預(yù)冷吸頭向解凍過的Matrigel(5mL)加入1 mL冷的DMEM/F12并反復(fù)吹打解凍混勻。

5. 吸出已解凍混勻的Matrigel加入離心管中剩余的DMEM/F12，使用10 mL移液管再次反復(fù)吹打混勻。

6. 分裝1.5 mL/孔于4個六孔板中，輕輕搖晃混勻。

7. 培養(yǎng)板置于室溫1小時后即可使用，或置于4℃冷藏過夜，兩周內(nèi)使用。

H9人胚胎干細胞培養(yǎng)操作

1)H9人胚胎干細胞復(fù)蘇方法(以6孔板為例)

1. 將水浴鍋預(yù)熱至37℃，并將Matrigel包被的6孔板，提前放置生物安全柜中約1小時恢復(fù)至室溫(15~30℃)。

2. 取4 mL hESC/iPSC完全培養(yǎng)基，按照1:4000比例加入1 μL的hESC/iPSC Supplement C，恢復(fù)至室溫(15~30℃)。

注意：不要在37℃水浴鍋中預(yù)溫培養(yǎng)基。

3. 取出1支冷凍的細胞置于37℃水浴鍋手持輕輕搖晃，2 min內(nèi)解凍，肉眼觀察細胞懸液內(nèi)冰晶即將完全消失時取出。

4. 75%酒精無塵紙擦拭凍存管表面，轉(zhuǎn)入生物安全柜;將細胞懸液移到事先準備好的15 mL 離心管中，隨后緩慢逐滴加入10mL DMEM/F12，過程中輕柔晃動混勻細胞，160g離心5 min。

5. 吸棄上清，加入預(yù)溫的4 mL的hESC/iPSC完全培養(yǎng)基+hESC/iPSC Supplement C制備細胞懸液，盡量避免吹打。

注：可留20 μL上清液，輕彈管底，使細胞懸浮液更均勻，避免成較大細胞團。

6. 吸除6孔板中2孔的Matrigel包被液，將細胞懸液按照2 mL/孔接種到1個孔中。

7. 水平十字搖勻三次，置于37℃，5% CO2濃度，飽和濕度的培養(yǎng)箱中，再次水平十字搖勻三次培養(yǎng)。

8. 18-24小時后換新的hESC/iPSC完全培養(yǎng)基，之后每天更換培養(yǎng)基。

注：在hESC培養(yǎng)過程中，如果細胞的匯合度超過50%，建議更換培養(yǎng)基時，培養(yǎng)基的體積增加至3-4mL/孔。

2)H9人胚胎干細胞傳代方法(以6孔板為例)

1. 傳代條件：① 細胞匯合度達85%左右(如圖1(C-D)所示)，一般情況下每3-4天傳代;

② 細胞匯合度較低，生長密度分布不均勻。

注：即使克隆團較小、匯合度不足，也建議不要連續(xù)培養(yǎng)超過5天。

2. 傳代比例：可根據(jù)細胞生長狀態(tài)和實驗需要按1:5~1:12的比例進行傳代，如果細胞正常，克隆團匯合度85%，大小均勻(如圖1(C-D)所示)，建議按照1:8進行傳代，如果密度偏低，則可降低傳代比例;密度偏高，則增加傳代比例。

注：1:8傳代就是1個孔瓶傳8個孔(以6孔板為例)。

3. 將 Matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中約1小時恢復(fù)至室溫(~25℃)。

4. 根據(jù)傳代接種的孔數(shù)準備2 mL/孔的hESC/iPSC完全培養(yǎng)基，并按1：4000比例加入hESC/iPSC Supplement C，恢復(fù)至室溫(~25℃)。

5. 將 Matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中約1小時恢復(fù)至室溫(~25℃)。

6. 根據(jù)傳代接種的孔數(shù)準備2 mL/孔的hESC/iPSC完全培養(yǎng)基，并按1：4000比例加入hESC/iPSC Supplement C，恢復(fù)至室溫(~25℃)。

7. 將孔內(nèi)培養(yǎng)基吸取，加入2 mL/孔的DPBS(不含鈣鎂)，輕輕搖晃并吸取。

8. 加入2 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution使溶液完全覆蓋孔底。

9. 置于37℃培養(yǎng)箱中孵育8-9 min。

注：① 消化8-9 min后鏡下觀察細胞變化，當大部分細胞變亮變圓，且細胞尚未脫離基質(zhì)或漂起時即可終止消化，若大部分細胞仍未變亮，則需要延長消化時間;

② 保持6孔板與培養(yǎng)箱金屬隔板直接接觸，使6孔板受熱均勻，不要疊放。

圖1. hESC/iPSC完全培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)hESC細胞形態(tài)圖：(A)和(C)分別為hESC細胞培養(yǎng)第2和4天時低倍鏡hESC培養(yǎng)形態(tài)圖示，(B)和(D)為培養(yǎng)至第2和4天時的高倍鏡hESC培養(yǎng)形態(tài)圖。

10. 消化結(jié)束后輕輕地將細胞培養(yǎng)板拿回生物安全柜，避免震蕩搖晃細胞，傾斜并吸除hESC/iPSC Passage Solution。

11. 及時加入2 mL/孔預(yù)溫的hESC/iPSC完全培養(yǎng)基+ hESC/iPSC Supplement C，水平十字搖晃6孔板使細胞脫離基質(zhì)。

注：① 加hESC/iPSC完全培養(yǎng)基 + hESC/iPSC Supplement C時，可輕柔吹打細胞1-2次，不能超過2次，避免反復(fù)吹打;有部分細胞(10%～15%)未脫離基質(zhì)是正?，F(xiàn)象，若有大量細胞未脫離則需延長消化時間(< 10min)。

圖2：消化hESC細胞不同時間形態(tài)圖：(A)消化8 min低倍鏡hESC培養(yǎng)的的形態(tài)圖;(B)消化9 min低倍鏡hESC培養(yǎng)的的形態(tài)圖。

② hESC細胞不能長時間處于hESC/iPSC Passage Solution(<15 min)，所以收集接種細胞時操作必須快速,以及最好一次操作不要超過4孔(六孔板)。

12. 吸取6孔板中的Matrigel溶液，加入預(yù)溫的hESC/iPSC完全培養(yǎng)基+ hESC/iPSC Supplement C 2 mL/孔。

13. 在6孔板上標記細胞名稱、代次、傳代比例、日期、操作人。將步驟9獲得的細胞懸液輕輕搖勻，按預(yù)先設(shè)定的傳代比例均勻分配于孔板中。

注：為了鋪板均勻并降低對細胞的損傷，可以將步驟9獲得的細胞懸液收集至2mL離心管，輕柔顛倒混勻細胞1-2次;再按照傳代比例接種。

14. 接種后，水平十字搖勻6孔板三次，置于37℃，5% CO2濃度，飽和濕度的培養(yǎng)箱中， 再次水平十字搖勻6孔板三次，培養(yǎng)過夜。

15. 18-24小時后更換新hESC/iPSC完全培養(yǎng)基，此后每天換液，4-5天后繼續(xù)傳代/凍存。

3)H9人胚胎干細胞凍存方法(以6孔板為例)

1. 當細胞匯合度達85%左右(如圖1(C-D)所示)可收獲凍存，一般6孔板每孔可凍存1管。

2. 準備相應(yīng)數(shù)量的1.5/2 mL凍存管，標記細胞名稱、代次(P#)、日期、操作人。

3. 取出4℃冰箱中的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，置于室溫預(yù)溫，使用前注意搖勻。

4. 吸取上清液，加入2 mL/孔的DPBS(不含鈣鎂)，輕輕搖晃數(shù)次，再吸取。

5. 加入2 mL/孔的hESC/iPSC Passage Solution，將細胞置于37℃培養(yǎng)箱中，計時8-9 min(可參考“六、傳代hESC/iPSC”步驟)。

6. 消化結(jié)束，輕輕取出培養(yǎng)板，吸取hESC/iPSC Passage Solution。

7. 搖勻預(yù)溫的hESC/iPSC Cryopreservation Solution，每孔加入1 mL凍存液，輕柔吹打，水平十字搖勻3次，隨后吸取細胞懸液加入1.5/2 mL凍存管中。

8. 將細胞置于梯度程序降溫盒中，并置-80℃冰箱中過夜，次日轉(zhuǎn)入液氮罐中長期保存。

H9人胚胎干細胞培養(yǎng)注意事項

1.復(fù)蘇H9人胚胎干細胞時，細胞懸液離心后，要避免弄散細胞團，否則將降低細胞貼壁率和成活率;

2.培養(yǎng)H9人胚胎干細胞過程中，需要每天換液;

3.如在培養(yǎng)過程中觀察到明顯的分化細胞集落，及時刮除;

4.當細胞集落變得較大、中心變得密集和明亮(對比其邊緣)而相鄰的集落即將融合時，必須進行傳代。細胞集落融合后很容易自發(fā)分化;

5.如果傳代前觀察到細胞分化較多，可在鏡下尋找未分化集落并在培養(yǎng)器皿底部標記好，消化后(該過程一定不要超過1Min)用細胞刮刀刮下該區(qū)域細胞進行傳代培養(yǎng);

6.H9人胚胎干細胞凍存時同樣要求注意保持細胞團完整。

H9人胚胎干細胞收貨注意事項

1. 收到H9人胚胎干細胞后首先觀察細胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，干冰運輸?shù)募毎麢z查干冰是否完全揮發(fā)，細胞是否解凍，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請及時和我們聯(lián)系。

2. 仔細閱讀細胞說明書，了解細胞相關(guān)信息，如細胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細胞因子等，確保細胞培養(yǎng)條件一致，若由于培養(yǎng)條件不一致而導(dǎo)致細胞出現(xiàn)問題，責任由客戶自行承擔。

3. 請客戶用相同條件的培養(yǎng)基用于細胞培養(yǎng)。

4. 建議客戶復(fù)蘇細胞后前3天各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態(tài)，便于和我司技術(shù)部溝通交流。由于運輸?shù)脑?，H9人胚胎干細胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請及時和我們聯(lián)系，告知細胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤回訪直至問題解決。

5. 該細胞僅供科研使用。

H9人胚胎干細胞應(yīng)用

胚胎干細胞(Embryonic stem cell，ESCs，簡稱ES、EK或ESC細胞)是早期胚胎(原腸胚期之前)或原始性腺中分離出來的一類細胞，它具有體外培養(yǎng)無限增殖、自我更新和多向分化的特性。無論在體外還是體內(nèi)環(huán)境，ES細胞都能被誘導(dǎo)分化為機體幾乎所有的細胞類型—這象征著它具有非好的醫(yī)療應(yīng)用前景，尤其是移植醫(yī)學。