細(xì)胞培養(yǎng)最大的危險是發(fā)生培養(yǎng)物的細(xì)菌、真菌和病青等微生物的污染，為更好地保證無菌間內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)處于一個良性的操作環(huán)境，小逸特地整理了關(guān)于在細(xì)胞培養(yǎng)過程中如何消毒滅菌及有效避免污染，供科研小伙伴參考。

要控制污染問題的出現(xiàn)就要對可能引起污染的因素以及實驗室常規(guī)滅菌與消毒的措施有所認(rèn)識污染主要是由于操作者的疏忽而引起，常見的原因有操作間或周周空間的不潔，境養(yǎng)皿和培養(yǎng)液消毒不合格或不徹底。由于有關(guān)培養(yǎng)的每個環(huán)節(jié)的失誤均能導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，故細(xì)胞培養(yǎng)的每個環(huán)節(jié)都應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)范，防止發(fā)生污染。

細(xì)胞培養(yǎng)對無菌環(huán)境的要求較為嚴(yán)格。微生物污染通常是造成細(xì)胞培養(yǎng)失敗的主要原因，細(xì)胞間的殺菌主要涉及空氣的殺菌，常見消毒方法分為三類：物理滅菌法(紫外線、濕熱、干烤、過濾等)，化學(xué)滅菌法(各種化學(xué)消毒劑)和抗生素。

細(xì)胞培養(yǎng)常見消毒方法

1.物理滅菌法

1.1紫外線消毒

紫外線是一種低能量的電磁輻射，可殺死多種微失物。革蘭阻性菌最為敏感。其次是陽性菌。再次為芽孢、真菌孢子的抵抗力最強。紫外線的直接作用是通過破環(huán)微生物的核酸及蛋白質(zhì)等而使其滅活，間接作用是通過紫外線照射產(chǎn)生的臭氧殺死微生物。直接照射培養(yǎng)室消毒，用法簡單，效果好。

紫外燈的消毒效果同紫外燈的輻射強度和照射劑量呈正相關(guān)，輻射強度隨燈距離 增加而降低，照射劑量和照射時間呈正比。因此紫外燈同被照射物的距離和照射時間要適合。離地面2米的30W燈可照射9平方米房間，每天照射2-3小時，期間可間隔30分鐘。燈管離地面2米以外要延長照射時間，2.5 米照射效果較差。紫外燈照射工作臺的距離不應(yīng)超過1.5米，照射時間30分鐘為宜。由于上述各種情況的不確定性，導(dǎo)致紫外線殺菌效果不是很理想，一般般需要過夜殺菌。此外紫外線對人體有傷害作用，紫外燈不僅對皮膚、眼睛傷害，且對培養(yǎng)細(xì)胞與試劑等也產(chǎn)生不良影響，因此不要在紫外線燈照射下進行操作。

1.2高溫濕熱滅菌

壓力蒸汽滅菌是最常用的高溫濕熱滅菌方法。對生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白質(zhì)變性凝固而使微生物死亡。布類、物、璃器皿、屬器皿、膠和某些培養(yǎng)液都可以用這方法滅菌。

不同壓力蒸汽所達(dá)到的溫度不同，不同消毒物品所需的有效消毒壓力和時間不同。從壓力蒸汽消毒器中取出消毒好的物品(不包括液體)，應(yīng)立即放到60-70℃烤箱內(nèi)烘干，再貯存?zhèn)溆茫駝t，潮濕的包裝物品表面容易為微生物污染。煮沸消毒也是常用的濕熱消毒方法，它具有條件簡單、使用方便等特點。

1.3高溫干熱消毒

干熱滅菌主要是將電熱烤箱內(nèi)物品加熱到160℃以上，并保持90-120分鐘，殺死細(xì)菌和芽孢，達(dá)到滅菌目的。主要用于滅菌玻璃器皿(如體積較大的燒杯、培養(yǎng)瓶)、金屬器皿以及不能與蒸汽接觸的物品(如粉劑、油劑)。

干熱滅菌后要關(guān)掉開關(guān)并使物品逐漸冷卻后在打開，切忌立即打開，以免溫度驟變而使箱內(nèi)的玻璃器皿破裂。干烤箱內(nèi)物品間要有空隙，物品不要靠近加熱裝置。

燒灼也是滅菌方法之一，常利用臺面上的酒精燈的火焰對金屬器皿及玻璃器皿口緣進行燒灼消毒。

1.4過濾除菌

是將液體或氣體用微孔薄膜過濾，使大于孔徑的細(xì)菌等微生物顆粒阻留，從而達(dá)到除菌目的。在體外培養(yǎng)時，過濾除菌大多用于遇熱容易變性而失效的試劑或培養(yǎng)液。目前，大多實驗室采用微孔濾膜濾器除菌。關(guān)鍵步驟是安裝濾膜及無菌過濾過程。

2.化學(xué)消毒法

最常見的是75%酒精及1%的新潔而滅。

75%酒精消毒的原理是通過使細(xì)菌或真菌表面的蛋白脫水，變性凝固，最終殺死細(xì)菌，主要用于操作者的皮膚、操作臺表面及無菌室內(nèi)的壁面處理。

1%新潔而滅的殺菌原理為：①改變細(xì)胞的滲透性，使細(xì)菌破裂;②使蛋白質(zhì)變性;③抑制細(xì)菌體內(nèi)某些酶，使之失去活性;④因其有良好的表面活性，可高濃度聚集于菌體表面，影響細(xì)胞的新陳代謝。新潔爾滅對化膿性細(xì)菌、腸道菌及部分病毒有一定的殺滅能力;對結(jié)核桿菌、真菌的殺滅效果不好;對細(xì)菌芽胞僅能起抑制作用。

3.抗生素消毒

抗生素主要用于消毒培養(yǎng)液，是培養(yǎng)過程中預(yù)防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不嚴(yán)重時的“急救”方法。不同抗生素殺滅微生物不同，應(yīng)根據(jù)需要選擇。

可用于細(xì)胞培養(yǎng)的消毒滅菌方法很多，但每種方法都有一定的適應(yīng)范圍。如常用的過濾除菌系統(tǒng)、紫外照射、電子殺菌燈、乳酸、甲醛熏蒸等手段消毒實驗室空氣;多用新潔而滅消毒實驗室地面;常用干熱、濕熱消毒劑浸泡、紫外照射等方法消毒培養(yǎng)用器皿;采用高壓蒸汽滅菌或過濾除菌方法消毒培養(yǎng)液。

細(xì)胞培養(yǎng)過程中環(huán)境污染是如何發(fā)生

1.取放細(xì)胞時引起的污染

細(xì)胞培養(yǎng)過程中，取放細(xì)胞是最基本的操作,培養(yǎng)房開關(guān)門的瞬間，環(huán)境中的微生物或多或少會進入培養(yǎng)箱中，而且內(nèi)外溫差導(dǎo)致內(nèi)門冷凝水的產(chǎn)生，極易吸附微生物，都是造成培養(yǎng)箱污染的風(fēng)險因素。

2.滅菌不徹底造成的二次污染

細(xì)胞培養(yǎng)過程中，因其它操作問題(如培養(yǎng)基潑灑，水盤污染等)，造成培養(yǎng)房的大規(guī)模污染也時常會發(fā)生， 此時就需要對培養(yǎng)箱進行滅菌消毒，常規(guī)的消毒(如紫外照射)只能達(dá)到表面消毒的效果，特別是對真菌等頑固性污染，無法進行徹底滅菌，導(dǎo)致后續(xù)培養(yǎng)過程中細(xì)胞污染頻發(fā)。

如何有效避免污染

1.重視細(xì)胞房管理工作，規(guī)范操作

定期進行細(xì)胞房清潔消毒工作,規(guī)范實驗人員操作(如身著白大褂、換鞋等)，創(chuàng)造潔凈培養(yǎng)環(huán)境。

2.避免頻繁查看細(xì)胞

做好實驗規(guī)劃，減少培養(yǎng)箱門開關(guān)的頻率，取放細(xì)胞時需佩戴潔凈的手套，并用少量的70%醫(yī)用酒精(過多會導(dǎo)致培養(yǎng)箱中殘留乙醇蒸汽)擦拭培養(yǎng)瓶/皿表面，從而降低細(xì)胞培養(yǎng)箱污染的風(fēng)險。

3.定期維護和滅菌，預(yù)防污染

定期清潔維護，培養(yǎng)箱內(nèi)用水滅菌后使用并定期更換，選擇培養(yǎng)箱時，可優(yōu)先考慮有自動滅菌功能的培養(yǎng)箱。細(xì)胞房一旦發(fā)生污染，及時進行消毒滅菌工作。