小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞簡(jiǎn)介

肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞(hepatocytes)是肝臟的主要組成和功能細(xì)胞。原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞在肝臟疾病的體外模擬、肝病藥物篩選、新藥安全性評(píng)估等領(lǐng)域都有不可替代的應(yīng)用，并在肝細(xì)胞移植治療、體外生物人工肝等領(lǐng)域都有眾多潛在的應(yīng)用價(jià)值。但長(zhǎng)期以來(lái)，原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞都無(wú)法體外長(zhǎng)期培養(yǎng)，更無(wú)法體外擴(kuò)增，一直是肝臟研究領(lǐng)域的關(guān)鍵障礙。

小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)步驟

小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)主要試劑

戊巴比妥、小鼠肝細(xì)胞灌注液1 (Perfusion buffer 1) 預(yù)熱、小鼠肝細(xì)胞灌注液11 (Perfusion buffer 11) 預(yù)熱、小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)基、留置針、鑷子及剪刀、注射器、70um細(xì)胞篩、預(yù)冷離心機(jī)、水浴鍋、促貼壁培養(yǎng)基 預(yù)冷

小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞操作步驟

1. 迅速麻醉小鼠，固定小鼠，75%酒精清理腹部

2. 腹部皮肉分離后剪開(kāi)肌肉層至胸膈膜，并將內(nèi)臟小腸等撥至自己右前方，充分暴露門(mén)靜脈和下腔，在我們對(duì)應(yīng)的左側(cè)皮膚剪開(kāi)口子用于引流灌流消化液體。

3. 在下腔靜脈處入針，拔出導(dǎo)針有回血后用手固定

4. 灌流灌注液1 (Perfusion buffer 1)，緩慢灌入，可見(jiàn)肝臟充盈，此時(shí)剪開(kāi)門(mén)靜脈引流，1-2min內(nèi)推完10 mL至肝臟內(nèi)無(wú)血液

5. 換上肝細(xì)胞灌注液11 (Perfusion buffer 11)，低速灌流，并節(jié)律性擠壓門(mén)靜脈切口(擠壓5-10s左右，間隔30s-1min,讓肝臟充盈，提高消化率)，持續(xù)消化5-10min不等，消化肝臟直至用棉簽按壓肝臟有塌陷感或者部分透明感，條紋樣的裂紋

6. 將肝小葉向上撥開(kāi)，找到門(mén)靜脈連接的肝門(mén)，用彎鑷鉗住，向前拉，剝離肝臟和膈膜連接后向上提，分離肝臟和內(nèi)臟組織連接

7. 置入含有10mL預(yù)冷培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)，隨后用鑷子撕裂肝包膜(直接撕裂肝小葉更迅速直接)，消化得當(dāng)，撕裂后即有細(xì)胞掉落，液體變渾濁，用鑷子夾住肝門(mén)晃落細(xì)胞或者用1mL槍輕輕吹打。

8. 用70um過(guò)濾器過(guò)濾到含10mL預(yù)冷促貼壁培養(yǎng)基的50mL離心管，此后操作注意保持低溫，可提高肝細(xì)胞活性。

9. 50g，4℃，1min(第一次離心可設(shè)置2min，在1min后按stop)后吸走上清

10. 10mL~20mL(一只小鼠差不多10mL足夠)預(yù)冷促貼壁培養(yǎng)基重懸后，計(jì)數(shù)和細(xì)胞活率，鋪板

11. 12h后可換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24-48h，一般會(huì)直接用于實(shí)驗(yàn)

6cm培養(yǎng)皿細(xì)胞量2x106cells

10cm培養(yǎng)皿細(xì)胞量5-6x106cells

小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞鑒定

1.形態(tài)學(xué)鑒定

倒置顯微鏡下觀(guān)察肝細(xì)胞，剛分離的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞呈分散狀態(tài)，圓球形，細(xì)胞體透亮、細(xì)胞核清晰;接種后 6 h，部分肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞開(kāi)始貼壁，細(xì)胞形狀呈現(xiàn)不規(guī)則狀，有向外延伸趨勢(shì)，相鄰的細(xì)胞間開(kāi)始建立連接;培養(yǎng) 72 h，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞呈不規(guī)則多角形，相鄰肝細(xì)胞彼此連

接更加緊密，形成索狀或島狀結(jié)構(gòu)

2. 標(biāo)志物檢測(cè)

角蛋白 18(CK18)是正常肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中高特異性表面抗原，可用來(lái)鑒定肝細(xì)胞。