iPSCs誘導(dǎo)擬胚體實驗介紹

擬胚體(EB)的形成實驗是胚胎及多能干細(xì)胞分化的主要步驟。在細(xì)胞脫離E8培養(yǎng)體系后，多能干細(xì)胞經(jīng) EB 形成培養(yǎng)基的刺激會自發(fā)分化形成三維聚集體，這種結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞的相互作用，比如細(xì)胞間的接觸和間隙連接的建立。

本方法基于Andrew Elefanty博士發(fā)表的APEL配方添加相關(guān)因子的非傳統(tǒng)多能干細(xì)胞貼壁誘導(dǎo)EB法。收集高質(zhì)量的iPSCs或者ESC細(xì)胞低密度接種于包埋了基質(zhì)膠或者VNT的12孔板中貼壁克隆2天后，停止換液消耗培養(yǎng)基中抑制細(xì)胞分化的因子，添加啟動分化的化合物，讓克隆團(tuán)懸浮分化，平均在4-5天內(nèi)形成大小，分化程度均一的懸浮擬胚體，添加相應(yīng)因子或化合物具有三胚層細(xì)胞譜系分化的潛能。

iPSCs誘導(dǎo)擬胚體實驗視頻教程

DO-階段1：iPSCs的培養(yǎng)(以IMMOCELL hiPSCs 為例)

1.取狀態(tài)良好，匯合度75-80%的hiPSCs細(xì)胞經(jīng)常溫的DPBS洗滌1-2次后，用immocell hPSC 溫和消化液+Y 消化7-8分鐘后，用1mlhPSC完全培養(yǎng)基終止消化，收集于1.5ml離心管中。

2.取10ul細(xì)胞懸液加入臺盼藍(lán)，測試細(xì)胞活力和數(shù)量，匯合度在8成的6孔板消化后細(xì)胞密度平均為100000，加入1ml完培稀釋到50000個細(xì)胞左右。部分細(xì)胞系的iPSCs克隆密度較小，可適當(dāng)降低稀釋比例。

3.準(zhǔn)備用Stem&Easy 即用鋪板液鋪板的常規(guī)12孔板(鋪板后需在4度過夜),每孔加入1ml的Stem&induce EB BasalMedium+補充液，常溫放置。

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4.將2ml的細(xì)胞懸液按每孔100ul的體積加入鋪好膠的12孔板中。2ml懸液可以滿足2個12孔板的EB誘導(dǎo)，至少形成120-300個懸浮成熟的囊狀EB。

D1-階段2：在 EB培養(yǎng)基中形成島狀iPSCs細(xì)胞克隆

1、將上述接種好的細(xì)胞十字搖勻后，置于常規(guī)培養(yǎng)箱中，部分實驗需求可置于低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2、階段2一共需要2天，每天都需要更換培養(yǎng)基，(1)是為了擴大單克隆的面積，(2)是為了將懸浮的單細(xì)胞去除凈化培養(yǎng)體系。

注意階段2中不要將細(xì)胞長時間的在室溫下觀察，過度搖晃，噴灑刺激性消毒液體如乙醇等。更換的培養(yǎng)基需要常溫預(yù)溫到RT。

D3到D4 階段3到4: iPSCs的懸浮

1.第三天開始克隆團(tuán)面積均一，邊緣變的明亮，說明即將懸浮形成EB，D3到D4都無需換液，僅僅只需加入Stem&Easy活性保持液10ul搖勻即可。

2.第四天部分克隆團(tuán)開始懸浮，但因為克隆團(tuán)差異部分EB可能還未發(fā)育成熟形成囊狀EB，視實驗需求補充EB完全培養(yǎng)基，平且每2小時用大口p1000槍頭吹打1-3次活置于孵化搖床上，降低EB的相互粘連。

成熟的囊狀EB具有三胚層譜系細(xì)胞標(biāo)志maker，在加入特定生長因子的情況下可以啟動特殊EB的分化程序。

D5后 階段4 EB的分化啟動(以中胚層及腎祖細(xì)胞特化為例)

1、在EB BasalMedium的基礎(chǔ)上添加FGF9加Heparin及GSK3-β抑制劑(具體比例可了解immocell Organoids&induce系列的腎類器官培養(yǎng)試劑盒或技術(shù)定制服務(wù)。

2、用寬口p1000移液器吸取EB和全部培養(yǎng)基，常溫自然沉降EB后，吸取上清，添加以上體系。在EB BasalMedium的基礎(chǔ)上添加FGF9加Heparin及GSK3-β抑制劑，誘導(dǎo)天數(shù)2-3天，無需換液。

3、用GSK3-β抑制劑激活1小時后實驗雙成基質(zhì)膠包埋法、小室培養(yǎng)法或懸浮培養(yǎng)法補充腎類器官誘導(dǎo)及成熟培養(yǎng)基，獲得成熟的腎類器官。

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