背景簡(jiǎn)介

二十世紀(jì)七十年代，F(xiàn)riedenstein首次從骨髓中分離出一種多能基質(zhì)細(xì)胞，呈梭形，可以進(jìn)行體外克隆和多向分化，被稱為CFU-Fs(colony-forming unit fibro-blasts)。隨后，這種骨髓來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞被進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)是間葉組織細(xì)胞譜系的共同前體細(xì)胞，因其具有干細(xì)胞的部分特性，而被命名為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)。

BMSCs來(lái)源方便，易于分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和純化，多次傳代擴(kuò)增后仍具有干細(xì)胞特性，免疫原性低。但是不同的分離培養(yǎng)方法使得BMSCs在體外擴(kuò)增時(shí)的純度、活性、表型和分化潛能差異很大，導(dǎo)致基礎(chǔ)研究結(jié)論各異和臨床試驗(yàn)效果不一。因此，深入認(rèn)識(shí)BMSCs不同分離方法和培養(yǎng)條件的優(yōu)缺點(diǎn)，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康淖龀鱿鄳?yīng)選擇，是進(jìn)行BMSCs實(shí)驗(yàn)研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

目前用于分離BMSCs的方法主要有五種，分別是貼壁篩選法、骨組織消化法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀分離法和磁珠分選法。

貼壁篩選法是利用細(xì)胞貼壁時(shí)間及貼壁牢固性的不同，逐步將非貼壁細(xì)胞和其它雜質(zhì)細(xì)胞去除的一種簡(jiǎn)單易行的方法，常用于干細(xì)胞的培養(yǎng)中，因此用于分離BMSCs最為廣泛。

利用BMSCs貼壁生長(zhǎng)特性，更換培養(yǎng)液逐步去除漂浮生長(zhǎng)的造血系統(tǒng)細(xì)胞即可獲得較純化的BMSCs;而且骨髓中的造血干細(xì)胞能分泌生長(zhǎng)因子和促貼壁物質(zhì),可促進(jìn)BMSCs貼壁生長(zhǎng)，貼壁篩選法也常被稱為直接培養(yǎng)法或者全骨髓法。

對(duì)初次培養(yǎng)者來(lái)說(shuō)，貼壁法分離BMSCs操作簡(jiǎn)單易掌握，不易發(fā)生污染，是一個(gè)較好的分離方法。

細(xì)胞形態(tài)

大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)

細(xì)胞特點(diǎn)

BMSCs來(lái)源方便，易于分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和純化，多次傳代擴(kuò)增后仍具有干細(xì)胞特性，免疫原性低。但是不同的分離培養(yǎng)方法使得BMSCs在體外擴(kuò)增時(shí)的純度、活性、表型和分化潛能差異很大，導(dǎo)致基礎(chǔ)研究結(jié)論各異和臨床試驗(yàn)效果不一。因此，深入認(rèn)識(shí)BMSCs不同分離方法和培養(yǎng)條件的優(yōu)缺點(diǎn)，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康淖龀鱿鄳?yīng)選擇，是進(jìn)行BMSCs實(shí)驗(yàn)研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

準(zhǔn)備工作

1. 6孔板，移液器，巴式管，1ml注射器，細(xì)胞培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)，低速離心機(jī)，4℃冰箱，-80℃冰箱，細(xì)胞凍存管，T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，眼科剪，尖頭鑷

2. 分離BMSC所需的試劑有逸漠生物間充質(zhì)干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基，逸漠生物胎牛血清，DMSO，雙抗，逸漠生物PBS , 逸漠生物0.25%胰酶，逸漠生物無(wú)血清細(xì)胞凍存液，

分離過(guò)程

1. 以頸椎脫臼法處死SPF級(jí)出生1-3D(最大也可至4周齡)C57BL/6J小鼠或者SD/Wistar大鼠，用75%乙醇浸泡。

2. 隨后在鼠的腿的位置剪開(kāi)外皮和內(nèi)皮，無(wú)菌狀態(tài)下取出雙側(cè)股骨和脛骨，浸泡于無(wú)菌含雙抗PBS溶液中。剔除股骨和脛骨周圍的肌肉、結(jié)締組織，用含雙抗的PBS溶液清洗三遍。

3. 用眼科剪剪去股骨和脛骨的兩端，暴露骨髓腔。

4. 用注射器以PBS反復(fù)沖洗骨髓腔直至骨頭發(fā)白。

5. 收集骨髓液，過(guò)40μM細(xì)胞篩。

6. 收集過(guò)濾骨髓液，離心，后加入培養(yǎng)基接種于培養(yǎng)基皿中置于37℃，5% CO2，飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

7. 24-48h后去懸浮，接下來(lái)的每3天換液一次，直到需要傳代。

注意事項(xiàng)

1. 全程無(wú)菌操作，鼠要提前酒精浸泡防止污染，仔細(xì)剝離去除血管和筋膜組織。

2. 剪開(kāi)皮膚的剪刀需與取材的剪刀相區(qū)分，避免污染。

大鼠/小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定

1. 形態(tài)學(xué)觀察

原代培養(yǎng)后，傳代2-3次，BMSCs呈現(xiàn)單層，梭狀或多枝狀的細(xì)胞形態(tài)，其直徑在25-30um，待細(xì)胞達(dá)到匯合時(shí)，它們形態(tài)上呈紡錘形，類似于成纖維細(xì)胞，貼壁較牢固。

2. 標(biāo)記物檢測(cè)

一般的標(biāo)準(zhǔn)為CD29、CD44、CD73、CD105為陽(yáng)性(>90%);CD34、CD45、CD11b為陰性(<5%)。

3. 誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)

在特定的誘導(dǎo)條件下，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞等多種細(xì)胞。

不同代系免疫表型

三系分化鑒定