第四節(jié)：hESC細(xì)胞傳代教程 

本視頻為廈門逸漠生物科技有限公司出品關(guān)于hESC細(xì)胞培養(yǎng)教程之：hESC細(xì)胞傳代，我們對(duì)每一步操作都做了演示，以便科研老師更好地理解hESC細(xì)胞傳代實(shí)驗(yàn)過程。

hESC細(xì)胞培養(yǎng)教程之：hESC細(xì)胞傳代

一.傳代條件

細(xì)胞滿足以下條件之一，即需要進(jìn)行細(xì)胞傳代：

1. 細(xì)胞匯合度達(dá)85%左右，移動(dòng)視野觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，整個(gè)皿密度均勻，沒有過大的克隆或者克隆過于致密的部分，一般皿中心部分比邊緣密度略大;一般情況下每4天傳代一次，即使克隆團(tuán)較小，匯合度不足，也建議不要連續(xù)培養(yǎng)超過5天；

2. 細(xì)胞匯合度較低，但干細(xì)胞集落過大，中央細(xì)胞生長(zhǎng)不良；

二.傳代間隔和比例

1. 可根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和實(shí)驗(yàn)需求按1:5~1:20的比列進(jìn)行傳代；

2. 如果細(xì)胞正常，克隆匯合度85%, 大小均勻，建議按照1:10進(jìn)行傳代；

3. 如果密度偏低，則可降低傳代比例，密度偏高，則增加傳代比例。

三.準(zhǔn)備工作

1. 提前30 min將Immocell hESC完全培養(yǎng)基，Immocell Y-27632（10 mM）和Corning Matrigel包被好的6孔板放置生物安全柜中，恢復(fù)至室溫；

2.吸取4 mL hESC完全培養(yǎng)基加入到離心管中，按照1:4000比例加入1 μl的Immocell Y-27632（10 mM），充分混勻，恢復(fù)至室溫；

四.hESC細(xì)胞傳代步驟

1. 從培養(yǎng)箱中取出待傳代細(xì)胞，吸棄孔內(nèi)的hESC培養(yǎng)基，加入2 mL/孔的DPBS，輕輕搖晃并吸棄，再加入2 mL/孔的Immocell EDTA傳代工作液（0.5 mM）,使溶液完全覆蓋孔底，將培養(yǎng)板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中；

注意：保持6孔板與培養(yǎng)箱金屬隔板直接接觸了，使其受熱均勻，不要疊放，設(shè)定消化時(shí)間10 min；

2. 吸棄6孔板中1孔的Matrigel包被液，加入預(yù)溫的 Y-27632+hESC完全培養(yǎng)基2 mL/孔在6孔板上做好標(biāo)記（細(xì)胞名稱，代次，傳代比例，日期和操作人）；

3. 消化結(jié)束后，從培養(yǎng)箱中取出消化的細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞的變化，大部分細(xì)胞變亮變圓，且細(xì)胞尚未脫離基質(zhì)或漂起時(shí)即可終止消化，若大部分細(xì)胞細(xì)胞仍未變亮，則需要延長(zhǎng)消化時(shí)間；

4. 將消化好的細(xì)胞培養(yǎng)板拿回生物安全柜中，避免震蕩搖晃細(xì)胞，傾斜吸棄Immocell EDTA傳代工作液，加入2 mL/孔預(yù)溫的Y-27632+hESC完全培養(yǎng)基，水平十字搖晃6孔板使細(xì)胞脫離基質(zhì)；

5.可輕柔吹打細(xì)胞1-2次；不能超過2次，避免將細(xì)胞吹打成單細(xì)胞狀態(tài)，注意避免刮擦細(xì)胞，有部分細(xì)胞（10-15%）未脫離基質(zhì)是正常，若有大量未脫離則需延長(zhǎng)消化時(shí)間；

6.一次操作不要超過1個(gè)6孔板，當(dāng)hESC培養(yǎng)基加入后要快速吸出。因?yàn)镋DTA傳代工作效果在hESC培養(yǎng)基加入后會(huì)很快被終止，在hESC培養(yǎng)基加入后細(xì)胞又會(huì)很快貼壁，而hESC培養(yǎng)基不能長(zhǎng)時(shí)間處于EDTA傳代工作液（<15min），所以收集接種細(xì)胞時(shí)操作必須快速。