基本信息

英文標(biāo)題：A Novel Luciferase-Based Reporter Gene Technology for Simultaneous Optical and Radionuclide Imaging of Cells

中文標(biāo)題：基于分裂式熒光素酶的分子張力傳感器實(shí)現(xiàn)生物力學(xué)信號(hào)生物發(fā)光可視化

發(fā)表期刊：《International Journal of Molecular Sciences》

影響因子：5.6

作者單位：

1.Department of Radiology and Nuclear Medicine, Erasmus MC Cancer Institute, University Medical Center Rotterdam, 3015 CE Rotterdam, The Netherlands

2.Department of Molecular Genetics, Erasmus MC Cancer Institute, University Medical Center Rotterdam, 3015 CE Rotterdam, The Netherlands

3.Promega Corporation, Madison, WI 53711, USA

作者信息：

Natasa Gaspar, Maryana Handula, Marcus C.M. Stroet

研究背景

隨著基因和細(xì)胞治療的發(fā)展，非侵入性、高靈敏度的多模態(tài)成像技術(shù)成為監(jiān)測細(xì)胞治療的關(guān)鍵需求。傳統(tǒng)成像方法(如生物發(fā)光成像BLI和放射性核素成像SPECT/PET)各有優(yōu)劣：BLI靈敏度高但穿透力弱，SPECT/PET可深部成像但需特異性探針。本研究基于NanoLuc熒光素酶系統(tǒng)，開發(fā)了一種新型雙模態(tài)報(bào)告基因技術(shù)，通過膜錨定的大亞基(TM-LgBiT)與放射性標(biāo)記的小肽(HiBiT)互補(bǔ)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)光學(xué)(BLI)與核素(SPECT)同步成像，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)信號(hào)衰減、探針特異性不足及臨床轉(zhuǎn)化困難的問題。

研究方法

研究構(gòu)建了跨膜錨定的LgBiT報(bào)告基因(TM-LgBiT)，并通過固相合成法設(shè)計(jì)放射性標(biāo)記的HiBiT肽(DOTA-6-Ahx-HiBiT)。體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了TM-LgBiT與HiBiT的高親和力(KD=0.7 nM)，并通過流式分選獲得穩(wěn)定表達(dá)的PC-3和HEK-293T細(xì)胞系。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，小鼠皮下移植TM-LgBiT陽性/陰性腫瘤，注射放射性探針(111In標(biāo)記)后，通過SPECT/CT和BLI同步成像，結(jié)合生物分布分析驗(yàn)證特異性。此外，通過免疫熒光和阻斷實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)靶向性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1：雙模態(tài)報(bào)告基因技術(shù)原理示意圖

示意圖展示了TM-LgBiT(跨膜錨定的大亞基)與放射性標(biāo)記的HiBiT肽(DOTA-6-Ahx-HiBiT)的結(jié)合機(jī)制。LgBiT通過PDGFR跨膜結(jié)構(gòu)域固定在細(xì)胞膜表面，HiBiT探針攜帶DOTA螯合劑標(biāo)記111In。兩者互補(bǔ)結(jié)合后激活NanoLuc酶活性，催化底物產(chǎn)生生物發(fā)光信號(hào)(BLI)，同時(shí)放射性核素實(shí)現(xiàn)SPECT成像。該設(shè)計(jì)避免了傳統(tǒng)多報(bào)告基因的復(fù)雜性，單基因即可支持雙模態(tài)成像。

圖2：HiBiT探針體外結(jié)合親和力與特異性驗(yàn)證

通過表面等離子體共振(SPR)測定，DOTA-6-Ahx-HiBiT與TM-LgBiT的親和力(KD=0.7 nM)顯著優(yōu)于無連接臂的HiBiT(KD=6.8 nM)。放射性標(biāo)記后，111In-DOTA-6-Ahx-HiBiT在TM-LgBiT陽性細(xì)胞中的結(jié)合信號(hào)比陰性對照高5倍(p<0.01)，而BLI信號(hào)未受影響，證明探針標(biāo)記未破壞互補(bǔ)活性。

圖3：活體BLI成像顯示快速特異性信號(hào)

在PC-3腫瘤模型中，靜脈注射HiBiT探針后30分鐘，BLI信號(hào)在TM-LgBiT陽性腫瘤區(qū)域顯著增強(qiáng)(信噪比提高10倍)，而陰性腫瘤無信號(hào)。結(jié)果表明，該系統(tǒng)可在活體內(nèi)快速(<2小時(shí))實(shí)現(xiàn)高特異性光學(xué)成像，且探針修飾不影響功能。

圖4：SPECT/CT成像與腫瘤靶向性驗(yàn)證

SPECT/CT顯示，TM-LgBiT陽性HEK-293T腫瘤在注射后1小時(shí)即出現(xiàn)放射性富集(3.6倍于對照)，且信號(hào)特異性隨時(shí)間增強(qiáng)。生物分布分析表明，腫瘤攝取達(dá)11.73% ID/g，腎臟高攝取(59.3% ID/g)提示探針主要通過腎排泄，需后續(xù)優(yōu)化藥代動(dòng)力學(xué)。

圖5：阻斷實(shí)驗(yàn)與免疫熒光驗(yàn)證

過量冷探針(100倍)使腫瘤放射性攝取下降至2.30% ID/g(p<0.05)，證實(shí)探針靶向性。免疫熒光染色顯示TM-LgBiT(HA標(biāo)簽)在腫瘤細(xì)胞膜高表達(dá)，與成像結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證系統(tǒng)可靠性。

圖6：雙模態(tài)成像協(xié)同性分析

BLI與SPECT信號(hào)在TM-LgBiT腫瘤中高度同步(R2=0.89)，離體生物分布顯示腫瘤放射性攝取與BLI強(qiáng)度正相關(guān)(p<0.01)。雙模態(tài)互補(bǔ)性為深層組織定量(SPECT)與高靈敏篩查(BLI)提供了協(xié)同解決方案。

研究結(jié)論

該技術(shù)成功實(shí)現(xiàn)了雙模態(tài)成像：BLI在30分鐘內(nèi)檢測到腫瘤特異性信號(hào)(信噪比提高10倍)，SPECT/CT在2小時(shí)內(nèi)顯示靶向腫瘤的放射性富集(11.73% ID/g)。生物分布表明腎臟為主要排泄途徑，阻斷實(shí)驗(yàn)證實(shí)探針特異性。研究首次證明NanoLuc系統(tǒng)在活體中的互補(bǔ)結(jié)合能力，為細(xì)胞治療(如CAR-T)的實(shí)時(shí)監(jiān)測提供了高靈敏、高特異性的工具，但需進(jìn)一步優(yōu)化探針穩(wěn)定性及免疫原性以推動(dòng)臨床轉(zhuǎn)化。