在生物醫(yī)學(xué)研究和藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域，生物發(fā)光成像技術(shù)因其高信噪比而被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞測(cè)定和動(dòng)物成像研究。然而，傳統(tǒng)的熒光素酶種類有限，限制了同時(shí)成像多個(gè)分子和細(xì)胞事件的能力。為了突破這一限制，科學(xué)家們開(kāi)發(fā)了一種新型的ATP非依賴性熒光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海蝦Oplophorus gracilirostris，并經(jīng)過(guò)工程改造以增強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。NanoLuc作為一種小型(19 kDa)、高亮度的熒光素酶，其亮度是傳統(tǒng)螢火蟲(chóng)或海腎熒光素酶的100倍，并且使用furimazine作為底物產(chǎn)生明亮的輝光型發(fā)光。

NanoLuc的意義在于其為雙報(bào)告基因生物發(fā)光分子成像提供了新的可能。它不僅可以在活體小鼠的表層和深層組織中成像，而且其生物發(fā)光隨時(shí)間的變化可以用來(lái)定量腫瘤生長(zhǎng)，甚至在少量血清中也能檢測(cè)到分泌的NL。此外，NanoLuc與螢火蟲(chóng)熒光素酶的結(jié)合使用，為在完整細(xì)胞和活體小鼠中定量TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)的兩個(gè)關(guān)鍵步驟提供了一種新型雙熒光素酶成像策略，從而在正常生理、疾病和藥物開(kāi)發(fā)中擴(kuò)展了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的成像能力。

NanoLuc的作用不僅體現(xiàn)在其高靈敏度和高穩(wěn)定性上，它還具有更小的尺寸，這使得在標(biāo)記細(xì)胞和蛋白質(zhì)時(shí)對(duì)樣本的侵入性更小，有助于保持細(xì)胞或組織的天然狀態(tài)。NanoLuc的快速反應(yīng)、低背景發(fā)光和多樣靈活等特點(diǎn)，使其在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。因此，NanoLuc作為一種新的報(bào)告基因，不僅增強(qiáng)了我們對(duì)生物過(guò)程的理解和疾病機(jī)理的研究，而且在開(kāi)發(fā)潛在治療方法和療法方面發(fā)揮了重要作用。

基本信息

英文標(biāo)題：Illuminating the mechanism and allosteric behavior of NanoLuc luciferase.

中文標(biāo)題：揭示NanoLuc熒光素酶的機(jī)制和變構(gòu)行為.

發(fā)表期刊：《Nature Communications》

影響因子：14.7

作者單位：

1.Loschmidt Laboratories, Department of Experimental Biology and RECETOX, Faculty of Science, Masaryk University, Kamenice 5, Bld. C13, 625 00, Brno, Czech Republic.

2.International Clinical Research Center, St. Anne’s University Hospital Brno, Pekarska 53, 656 91, Brno, Czech Republic.

作者信息：Michal Nemergut，Daniel Pluskal，Jana Horackova，Tereza Sustrova，Jan Tulis

研究背景

生物發(fā)光是一種自然現(xiàn)象，被廣泛用于生物檢測(cè)和照明技術(shù)。深海蝦Oplophorus gracilirostris的熒光素酶(OLuc)能產(chǎn)生藍(lán)色光，但其較小的19 kDa亞基單獨(dú)表達(dá)時(shí)不穩(wěn)定。通過(guò)蛋白質(zhì)工程，開(kāi)發(fā)了新型熒光素酶NanoLuc，它與furimazine(FMZ)底物結(jié)合，產(chǎn)生強(qiáng)烈光信號(hào)，比傳統(tǒng)熒光素酶強(qiáng)150倍。NanoLuc在多個(gè)生物技術(shù)領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用，但其催化機(jī)制和底物FMZ的溶解度、細(xì)胞毒性及成本問(wèn)題仍待解決。盡管已知NanoLuc的晶體結(jié)構(gòu)，熒光素結(jié)合的具體細(xì)節(jié)仍是研究的關(guān)鍵障礙。

研究方法

在本研究中，作者首先通過(guò)基因工程技術(shù)表達(dá)了NanoLuc熒光素酶，并利用FLUOStar Omega微孔板讀取器測(cè)定了其特異性活性。接著，作者使用GraphPad Prism軟件和KinTek Global Kinetic Explorer對(duì)酶動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行了擬合和模擬分析，以確定NanoLuc的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。此外，作者還通過(guò)晶體培養(yǎng)和X射線衍射技術(shù)解析了NanoLuc的晶體結(jié)構(gòu)，并運(yùn)用SAXS技術(shù)研究了其在溶液中的狀態(tài)。分子對(duì)接和模擬實(shí)驗(yàn)則通過(guò)AutoDock Vina和HTMD軟件進(jìn)行，以探究配體與受體間的相互作用。最后，作者通過(guò)RT-qPCR和Western blotting技術(shù)分析了基因表達(dá)和蛋白水平的變化，從而全面評(píng)估了NanoLuc熒光素酶的特性和應(yīng)用潛力。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1：NanoLuc熒光酶與FMA結(jié)合的結(jié)構(gòu)特征。

NanoLuc熒光酶與FMA(熒光素類似物)結(jié)合的結(jié)構(gòu)特征被詳細(xì)描繪。在FMA-oxyluciferin結(jié)合位點(diǎn)，2Fo-Fc電子密度圖顯示了1.2σ的輪廓水平。整體結(jié)構(gòu)以卡通形式呈現(xiàn)，NanoLuc不對(duì)稱二聚體(鏈A為青色，鏈B為藍(lán)色)與結(jié)合的FMA熒光素(黃色)一同展示。鏈A和鏈B的疊加顯示了導(dǎo)致對(duì)稱性破壞的結(jié)構(gòu)元素，包括螺旋H4、環(huán)L7和鏈S4，這些部分被橙色標(biāo)記。B因子橡皮泥表示法展示了NanoLuc同源二聚體的結(jié)構(gòu)，而二聚體界面可視化顯示了所有參與二聚體界面的殘基，以空間填充球的形式展示，F(xiàn)MA以黃色球體表示。通過(guò)Protein Contact Atlas計(jì)算和可視化的鏈A和B在NanoLuc二聚體中的相互作用在二級(jí)結(jié)構(gòu)水平上以弦圖表示。FMA結(jié)合的NanoLuc二聚體的表面表示揭示了FMA結(jié)合口袋，活性位點(diǎn)的殘基以棒狀表示，關(guān)鍵的氫鍵以虛線黃線顯示。NanoLuc與O. gracilirostris熒光酶(OLuc)催化單元的序列比對(duì)顯示了NanoLuc中的二級(jí)結(jié)構(gòu)元素，以及在NanoLuc工程中突變的氨基酸殘基，這些殘基以紅點(diǎn)標(biāo)記。比對(duì)上方的編號(hào)對(duì)應(yīng)于NanoLuc結(jié)構(gòu)(PDB ID: 5B0U)。

圖2：NanoLuc熒光酶CEI結(jié)合的晶體同源四聚體結(jié)構(gòu)。

NanoLuc熒光酶與CEI(另一種熒光素類似物)結(jié)合的晶體同源四聚體結(jié)構(gòu)被詳細(xì)解析。在CEI-oxyluciferin結(jié)合位點(diǎn)，2Fo-Fc電子密度圖以1.2σ的輪廓水平顯示。整體結(jié)構(gòu)展示了由兩個(gè)尾對(duì)尾排列的不對(duì)稱同源二聚體組成的NanoLuc同源四聚體(鏈A為青色，鏈B為藍(lán)色，鏈C為紫色，鏈D為綠色)。CEI熒光素以空間填充球的形式展示(綠色)。CEI結(jié)合的NanoLuc四聚體的表面表示揭示了結(jié)合口袋，活性位點(diǎn)的殘基以棒狀表示，關(guān)鍵的氫鍵以虛線黃線顯示。FMA(黃色)和CEI(綠色)的結(jié)合模式通過(guò)疊加展示，對(duì)比了兩種熒光素類似物與NanoLuc熒光酶的結(jié)合方式。

圖3：NanoLuc β-桶結(jié)構(gòu)的開(kāi)放與閉合構(gòu)象轉(zhuǎn)換。

NanoLuc熒光酶的β-桶結(jié)構(gòu)在開(kāi)放和閉合狀態(tài)之間發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)換。卡通圖展示了(i)無(wú)配體的apo-NanoLuc結(jié)構(gòu)(PDB ID: 5B0U)、(iii)FMA結(jié)合的NanoLuc結(jié)構(gòu)，以及(ii)它們的疊加。H93和Y94殘基以及FMA-熒光素以空間填充球的形式展示。在(i)無(wú)配體的apo-NanoLuc結(jié)構(gòu)(PDB ID: 5B0U)、(iii)FMA結(jié)合的NanoLuc結(jié)構(gòu)，以及(ii)它們的疊加中，近距離觀察熒光素結(jié)合表面口袋。R43、H57、K89、H93和Y94殘基以空間填充球的形式展示，F(xiàn)MA熒光素以黃色棒狀表示。2Fo-Fc電子密度圖在氯離子結(jié)合位點(diǎn)1和2處顯示1.2σ的輪廓水平。d和e展示了NanoLuc β-桶內(nèi)部在閉合(d)和開(kāi)放(e)狀態(tài)下的表面表示。注意，在閉合的β-桶狀態(tài)下，兩個(gè)氯離子被結(jié)合在β-桶內(nèi)部。

圖4：NanoLuc突變體的特性分析。

本研究對(duì)NanoLuc熒光酶突變體進(jìn)行了特性分析。a部分展示了NanoLuc突變體與CTZ(左列)和FMZ(右列)熒光素的相對(duì)熒光酶活性的熱圖，以NanoLuc野生型為100%參照。b部分展示了FMA結(jié)合的NanoLuc野生型不對(duì)稱二聚體結(jié)構(gòu)(i)、無(wú)熒光素的NanoLuc-Y94A突變體對(duì)稱二聚體結(jié)構(gòu)(ii)，以及它們的疊加(iii)。圖中展示了酪氨酸-酪氨酸門控Y81和Y94(A94)殘基以及FMA-熒光素，以空間填充球的形式展示。c部分是NanoLuc熒光酶CEI結(jié)合的熒光素結(jié)合位點(diǎn)的近距離視圖，展示了D9、H57和K89三個(gè)殘基，它們的突變可以增加與CTZ的生物發(fā)光，以青色空間填充球展示。其他蛋白殘基以青色棒狀展示，CEI-熒光素以綠色棒狀展示。d部分再次展示了NanoLuc突變體與CTZ(左列)和FMZ(右列)熒光素的相對(duì)熒光酶活性的熱圖，以NanoLuc野生型為100%參照。e部分展示了雙突變體NanoLuc-D9R/K89R和三突變體NanoLuc-D9R/H57A/K89R的動(dòng)力學(xué)參數(shù)(Km、kcat和kcat/Km)的相對(duì)增加倍數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差(s.e.)，以NanoLuc野生型為1。動(dòng)力學(xué)參數(shù)(Km、kcat和kcat/Km)的絕對(duì)值總結(jié)在表1中。f和g部分展示了培養(yǎng)的ARPE-19細(xì)胞表達(dá)原始NanoLuc或工程化NanoLucCTZ，并分別由EnduRen(f)或Nano-Glo Endurazine(g)底物提供能量的長(zhǎng)期活細(xì)胞生物發(fā)光成像。通過(guò)LuminoCell設(shè)備測(cè)量添加相應(yīng)熒光素后的熒光酶活性，積分時(shí)間為5分鐘。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表三個(gè)重復(fù)的平均酶活性。標(biāo)準(zhǔn)誤差以陰影區(qū)域圍繞平均曲線表示。

圖5：NanoLuc型熒光酶反應(yīng)的催化機(jī)制。

NanoLuc型熒光酶的催化機(jī)制涉及幾個(gè)關(guān)鍵步驟。首先，通過(guò)電子密度圖展示了azaCTZ在NanoLucCTZ催化位點(diǎn)的結(jié)合。其次，展示了NanoLucCTZ與azaCTZ結(jié)合的結(jié)構(gòu)，以及活性位點(diǎn)的關(guān)鍵殘基和水分子。突變實(shí)驗(yàn)顯示了活性位點(diǎn)殘基對(duì)熒光酶活性的影響。此外，還展示了NanoLucCTZ催化位點(diǎn)與不同底物模擬物的結(jié)合模式，以及分子氧和氫鍵的相互作用。

催化機(jī)制的簡(jiǎn)要概述如下：CTZ底物結(jié)合到β-桶結(jié)構(gòu)內(nèi)部的催化位點(diǎn)，通過(guò)一系列步驟包括自由基形成、分子內(nèi)環(huán)化和二噁烷酮中間體的生成，最終產(chǎn)生激發(fā)態(tài)的CEI產(chǎn)物并釋放藍(lán)光。R162殘基在催化過(guò)程中起到質(zhì)子轉(zhuǎn)移的作用。

圖6：NanoLuc復(fù)合物的分子對(duì)接和計(jì)算模擬。

本研究通過(guò)分子對(duì)接和計(jì)算模擬探討了NanoLuc復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)特性。a部分展示了FMZ(品紅色棒狀)與NanoLuc單體二聚體(鏈A為青色，鏈B為藍(lán)色卡通表示)的最佳對(duì)接姿態(tài)，并與晶體結(jié)構(gòu)中的FMA(黃色棒狀)進(jìn)行了比較。b部分展示了兩個(gè)潛在的通道(黃色和藍(lán)色球體)通往NanoLucCTZ(鮭魚色卡通表示)中心熒光素結(jié)合腔(綠色球體)的前后視圖。這些通道是通過(guò)Caver Web計(jì)算得出的。c部分展示了在封閉和開(kāi)放β-桶狀態(tài)下NanoLuc結(jié)構(gòu)的CTZ(橙色棒狀)的最終姿態(tài)，以及NanoLucCTZ開(kāi)放β-桶結(jié)構(gòu)。每個(gè)圖像中都展示了晶體結(jié)構(gòu)中的azaCTZ(透明綠色棒狀)作為參考。相互作用的芳香族殘基以細(xì)棒狀表示，H2/H3和H3/H4螺旋之間的距離(以埃為單位)由黃色虛線表示。相關(guān)的MD軌跡在補(bǔ)充電影1-3中展示。d部分展示了NanoLuc封閉β-桶結(jié)構(gòu)中引入的突變(L27V、K33N、K43R和Y68D)，這些突變?cè)贜anoLuc開(kāi)發(fā)的最后三分之一階段負(fù)責(zé)最大化FMZ熒光。e部分展示了FMZ在單體和二聚體NanoLuc表面口袋中結(jié)合的宏觀狀態(tài)的平衡概率。計(jì)算使用了隨機(jī)80%的數(shù)據(jù)進(jìn)行100次bootstrap。條形的高度對(duì)應(yīng)于平均值，誤差條顯示標(biāo)準(zhǔn)差。f部分展示了通過(guò)自適應(yīng)引導(dǎo)分子動(dòng)力學(xué)獲得的不同NanoLuc二聚體亞基被引導(dǎo)至12埃距離所需的平均力。

圖7：基于結(jié)構(gòu)的NanoLuc熒光酶作用模型。

本模型描述了NanoLuc熒光酶的作用機(jī)制，分為四個(gè)步驟：I. 底物分子進(jìn)入內(nèi)桶催化位點(diǎn)，熒光酶保持“開(kāi)放β-桶”構(gòu)象。II. 底物轉(zhuǎn)化為反應(yīng)產(chǎn)物，隨后發(fā)射出藍(lán)光。III. 產(chǎn)物從內(nèi)桶催化位點(diǎn)釋放。這一步驟伴隨著從開(kāi)放到閉合的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，以及產(chǎn)物重新結(jié)合到蛋白質(zhì)表面新形成的變構(gòu)位點(diǎn)。IV. 產(chǎn)物從表面變構(gòu)位點(diǎn)解離，允許循環(huán)回到催化前的“開(kāi)放β-桶”狀態(tài)。提供了代表性晶體結(jié)構(gòu)的PDB ID代碼。

研究結(jié)論

在NanoLuc熒光酶的研究中，科學(xué)家們?cè)诿副砻姘l(fā)現(xiàn)了一個(gè)由β-桶表面上單體(鏈A)的凹槽定義的新熒光素結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)底部由長(zhǎng)鏈S3和S5形成，側(cè)面由同一單體的鏈S1和S4構(gòu)成，而蓋子則由第二個(gè)單體(鏈B)的氨基端封閉。這個(gè)結(jié)合口袋與之前在兩個(gè)NanoLuc復(fù)合結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)的癸酸分子結(jié)合位點(diǎn)重疊。通過(guò)小角X射線散射(SAXS)分析，證實(shí)了NanoLuc在微摩爾濃度下以單體形式存在于溶液中。對(duì)比配體自由(apo形式)和配體結(jié)合的NanoLuc結(jié)構(gòu)，揭示了β-桶結(jié)構(gòu)在開(kāi)放和閉合狀態(tài)之間的構(gòu)象變化。結(jié)構(gòu)引導(dǎo)的突變體研究顯示，特定突變?nèi)鏒9R、H57A和K89R能顯著提高CTZ的生物發(fā)光，而不影響FMZ的生物發(fā)光。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，突變體NanoLucCTZ表現(xiàn)出比原始NanoLuc更強(qiáng)的生物發(fā)光，顯示出其在長(zhǎng)期活細(xì)胞成像中的優(yōu)勢(shì)。共結(jié)晶結(jié)構(gòu)揭示了azaCTZ分子結(jié)合在NanoLucCTZ開(kāi)放的β-桶結(jié)構(gòu)中的催化腔里。分子對(duì)接和自適應(yīng)抽樣模擬驗(yàn)證了晶體結(jié)構(gòu)，并揭示了熒光素進(jìn)入催化位點(diǎn)的路徑。自適應(yīng)抽樣模擬分析了FMZ在單體和二聚體NanoLuc結(jié)構(gòu)中的行為，發(fā)現(xiàn)FMZ傾向于結(jié)合到酶二聚體形式的表面變構(gòu)位點(diǎn)，并具有穩(wěn)定酶二聚體的強(qiáng)烈作用。綜合X射線晶體學(xué)、結(jié)構(gòu)引導(dǎo)的突變體研究和計(jì)算機(jī)模擬，提供了一個(gè)基于結(jié)構(gòu)的模型來(lái)解釋NanoLuc熒光素酶的作用機(jī)制。