基本信息

英文標題：MMP-2-triggered, mitochondria-targeted PROTAC-PDT therapy of breast cancer and brain metastases inhibition.

中文標題：乳腺癌及其腦轉(zhuǎn)移的MMP-2觸發(fā)線粒體靶向PROTAC-PDT治療

發(fā)表期刊：《Nature Communications》

影響因子：17.69

作者單位：四川大學華西醫(yī)院、海南大學藥學院

作者信息：Fan Tong, Yufan Wang, Yanyan Xu, Yang Zhou, Siqin He, Yufan Du, Wenqin Yang, Ting Lei, YujunSong, Tao Gong, Huile Gao.

研究背景

PROTAC技術是一種蛋白質(zhì)阻斷技術，具有抗腫瘤效果。

PROTAC技術的應用受到腫瘤內(nèi)分布和積累不足的限制。

設計了一種新的納米藥物dBET6@CFMPD，它結合了PROTAC和光動力療法(PDT)。

dBET6@CFMPD具有良好的生物分布性和保留性。

dBET6@CFMPD能夠有效抑制原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤的生長。

dBET6@CFMPD是一種有潛力的癌癥聯(lián)合治療納米藥物。

研究方法

研究設計：所有動物實驗均遵循川大倫理委員會指南，并經(jīng)倫理委員會批準。細胞系包括小鼠4T1乳腺癌細胞、E0771乳腺癌細胞和RAW264.7細胞，均經(jīng)過STR分析驗證。實驗過程中，腫瘤大小不超過1500 mm3。

材料準備：實驗所用材料包括氯素e6、MMP-2響應肽、BRD4抑制劑dBET6、DSPE-PEG2000-Mal、DSPE-PEG3400-NH2等，均購自國內(nèi)外試劑公司。

Ce6-PEGylated MMP-2響應肽的合成：通過 maleimide 反應將肽的末端 sulfhydryl 與 DSPE-PEG2000-Mal 相連，再與活化的 Ce6 形成偶聯(lián)物。

納米粒子的制備和表征：采用文獻報道的方法，將CFMPD、dBET6溶于DMF中，混合后加入水中，通過離心過濾得到納米粒子。利用DLS和TEM對納米粒子進行表征。

MMP-2響應性測試：將CFMPD和CFPD與MMP-2酶孵育，通過MALDI-TOF-MS監(jiān)測分子量變化。同時，利用DLS和TEM觀察納米粒子尺寸和形態(tài)變化。

細胞攝取實驗：4T1細胞與不同制劑孵育，通過流式細胞儀和熒光顯微鏡檢測細胞內(nèi)Ce6的攝取。

體內(nèi)分布和保留實驗：將小鼠接種4T1細胞建立乳腺癌模型，通過IVIS成像系統(tǒng)監(jiān)測不同制劑的體內(nèi)分布和腫瘤保留效果。

BBB穿透和腦積聚實驗：利用bEnd.3細胞建立BBB模型，檢測不同制劑的BBB穿透效率和腦積聚效果。

體內(nèi)抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移實驗：對小鼠進行乳腺癌細胞皮下注射，建立原發(fā)腫瘤和肺轉(zhuǎn)移模型，通過不同制劑治療，評估其體內(nèi)抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移效果。

免疫反應評估：收集腫瘤、DLN和脾臟細胞，通過流式細胞儀和ELISA檢測免疫細胞和細胞因子水平，評估免疫反應。

統(tǒng)計分析：所有數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，采用GraphPad Prism軟件進行統(tǒng)計分析，通過學生t檢驗和方差分析進行兩組或多組間的統(tǒng)計學比較。

實驗結果

圖1. 納米藥物的制備與表征。

要點：

a. 圖示說明：

dBET6@CFMPD 的組成及其對原發(fā)性乳腺癌和腦轉(zhuǎn)移的治療效果。

插圖由 BioRender.com 制作，并根據(jù)知識共享署名-非商業(yè)性-禁止演繹 4.0 國際許可發(fā)布。

b. 納米藥物表征：

dBET6@CPD 的動態(tài)光散射(DLS)結果和透射電鏡(TEM)圖像。

dBET6@CFPD 的TEM圖像。

dBET6@CFMPD 的TEM圖像(標尺 = 200 納米)。

c. 分子質(zhì)量變化：

CFPD 和 CFMPD 在與MMP-2孵育4小時和24小時后的分子質(zhì)量變化，通過基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)分析檢測。

補充圖 10 和 11 中包含了 e, f 的 MALDI-TOF-MS 譜圖。

d. MMP-2 孵育后的TEM圖像：

dBET6@CFMPD 與MMP-2孵育后的TEM圖像(標尺 = 2 微米)。

e. 細胞處理后的TEM圖像：

經(jīng)CFPD處理的細胞的TEM圖像(標尺 = 500 納米)。

經(jīng)CFMPD處理的細胞的TEM圖像和放大圖像。

紅色箭頭和藍色箭頭分別指示球狀納米顆粒和納米纖維。

f. 數(shù)據(jù)提供：

源數(shù)據(jù)以源數(shù)據(jù)文件的形式提供。

圖2. 細胞攝取、保留和線粒體靶向。

要點：

a, b 細胞攝取測定：

使用熒光顯微鏡對不同制劑的細胞攝取進行測定(標尺 = 100 微米)。

c, d 細胞攝取測定：

使用流式細胞儀對不同制劑的細胞攝取進行測定(n = 3 個獨立細胞系)。

e 共聚焦圖像：

4T1 間充質(zhì)干細胞與游離Ce6、CPD、CFPD和CFMPD孵育12小時后的共聚焦圖像(標尺 = 100 微米)。

f 腫瘤球體切片定量分析：

對100微米厚的腫瘤球體切片進行定量分析。

g 線粒體定位分析：

對4T1細胞中不同制劑的線粒體定位進行分析(標尺 = 20 微米)。

h TEM圖像：

經(jīng)CFMPD處理的細胞的透射電鏡圖像(標尺 = 1 微米)，紅色箭頭指示線粒體嵴。

數(shù)據(jù)表示：

所有數(shù)據(jù)均以平均值 ± 標準差(SD)的形式呈現(xiàn)。

統(tǒng)計學比較：

兩組之間的比較采用雙尾Student's t檢驗;多組之間的比較采用單因素方差(ANOVA)及Tukey后續(xù)檢驗。

顯著性判定：

當p值 < 0.05時，認為差異具有統(tǒng)計學意義。

數(shù)據(jù)提供：

源數(shù)據(jù)以源數(shù)據(jù)文件的形式提供。

圖3. BRD4抑制和體外抗腫瘤效果。

a. 通過Western blot分析4T1細胞中BRD4的抑制情況以及EMT下調(diào)情況。G1-G6分別代表對照組、dBET6&Ce6+L組、CFMPD+L組、dBET6@CPD+L組、dBET6@CFPD+L組和dBET6@CFMPD+L組。

b. 檢測不同制劑處理4T1細胞后的PD-L1表達水平。

c. 通過流式細胞儀檢測不同制劑處理后4T1細胞內(nèi)ROS的生成情況(n=3個獨立實驗細胞系)。

d. 與父本納米粒子孵育的4T1細胞進行MTT細胞活力實驗。

e. 與BET6負載納米粒子孵育的4T1細胞進行MTT細胞活力實驗(n=3個獨立細胞系)。

f. 檢測不同制劑處理后4T1細胞的凋亡情況。

g. 統(tǒng)計凋亡分析的結果(n=3個獨立細胞系)。

h. 對不同制劑孵育的4T1細胞進行活/死雙重染色(標尺=100μm)。

所有數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。兩組間的比較采用雙尾Student's t檢驗，多組間的比較采用單因素方差分析(ANOVA)及Tukey事后檢驗。p值<0.05視為有統(tǒng)計學意義的差異。

源數(shù)據(jù)以Source Data文件形式提供。

圖4. ICD評估、巨噬細胞極化及抗轉(zhuǎn)移效果。

a, b. 通過共聚焦顯微鏡和流式細胞儀檢測4T1細胞表面的CRT暴露情況(標尺=50μm，n=3個獨立細胞系)。

c, d. 檢測不同制劑孵育后腫瘤細胞外分泌的HMGB-1和ATP水平(n=3個獨立細胞系)。

e–g. 檢測不同制劑處理后RAW264.7細胞分泌的IL-10、TGF-β和IFN-γ水平(n=3個獨立細胞系)。

h, i. 通過流式細胞儀分析不同制劑孵育后RAW264.7細胞中CD86+和CD206+細胞的豐富度(n=3個獨立細胞系)。

j–l. 顯微鏡下觀察不同制劑處理后4T1細胞的傷口愈合實驗、遷移實驗和侵襲分析(標尺=100μm)。

所有數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。兩組間的比較采用雙尾Student's t檢驗，多組間的比較采用單因素方差分析(ANOVA)及Tukey事后檢驗。p值<0.05視為有統(tǒng)計學意義的差異。

源數(shù)據(jù)以Source Data文件形式提供。

圖5. 納米藥物體內(nèi)靶向效率和保留效果評估。

a. 靜脈注射后1、2、4、8、12、24小時對小鼠進行體內(nèi)成像。

b. 腫瘤的體外成像。

c. 靜脈注射后24小時對主要器官和腫瘤進行半定量分析(n=4只小鼠)。

d. 腫瘤內(nèi)注射后5分鐘、4、8、12、24、36和48小時對小鼠進行體內(nèi)熒光成像。

e. 腫瘤的體外成像(48小時)。

f. 腫瘤的半定量分析(n=4只小鼠)。

g. 腫瘤冷凍切片的熒光分布情況(標尺=100μm)。

所有數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。兩組間的比較采用雙尾Student's t檢驗，多組間的比較采用單因素方差分析(ANOVA)及Tukey事后檢驗。p值<0.05視為有統(tǒng)計學意義的差異。

源數(shù)據(jù)以Source Data文件形式提供。

圖6. 腦靶向能力評估。

a. 血腦屏障(BBB)體外構建過程示意圖以及BBB穿越過程。圖1a使用BioRender.com創(chuàng)建，并根據(jù)知識共享署名-非商業(yè)性-禁止演繹4.0國際許可發(fā)布。

b. 經(jīng)過4小時納米粒子(NPs)引入后，下室液體中的熒光強度(n=3個獨立實驗單元)。

c. 下室中4T1細胞攝取的納米粒子的熒光強度(n=3個獨立系)。

d. 靜脈注射后1、2、4、8小時，帶有腦轉(zhuǎn)移腫瘤的小鼠的體內(nèi)成像。

e, f. 靜脈注射后8小時，主要器官和大腦的體外成像。

g, h. 主要器官和大腦的半定量分析(n=4只小鼠)。

所有數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。兩組間的比較采用雙尾Student's t檢驗，多組間的比較采用單因素方差分析(ANOVA)及Tukey事后檢驗。p值<0.05視為有統(tǒng)計學意義的差異。

源數(shù)據(jù)以Source Data文件形式提供。

圖7. 體內(nèi)抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移效果評估。

a. 每2天記錄一次4T1腫瘤小鼠的腫瘤體積(n=6只小鼠)。

b. 4T1乳腺癌模型的腫瘤重量(n=6只小鼠)。

c. 接受不同制劑治療的 mice 的體重(n=6只小鼠)。

d. 腫瘤切片的Ki67和TUNEL染色實驗(標尺=2毫米)。

e, f. 肺轉(zhuǎn)移的體外成像和統(tǒng)計結果(n=5只小鼠)。

g. 肺組織的HE染色圖像(HE圖像中的標尺=5毫米，放大圖像中的標尺=100微米)。

h, i. 復發(fā)腫瘤的重量和體外成像(n=5只小鼠)。

G1–G8分別代表對照組、dBET6組、Ce6+L組、CFMPD+L組、dBET6@CFMPD組、dBET6@CPD+L組、dBET6@CFPD+L組和dBET6@CFMPD+L組。

所有數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。兩組間的比較采用雙尾Student's t檢驗，多組間的比較采用單因素方差分析(ANOVA)及Tukey事后檢驗。p值<0.05視為有統(tǒng)計學意義的差異。

源數(shù)據(jù)以Source Data文件形式提供。

圖8. 原發(fā)腫瘤和腦轉(zhuǎn)移瘤的抑制效果。

a. 攜帶腦轉(zhuǎn)移瘤的小鼠的生物發(fā)光成像。

b. 腫瘤接種后第8、16和24天的生物發(fā)光成像半定量結果(n=10只小鼠)。

c. 原發(fā)腫瘤的體積(n=10只小鼠)。

d, e. 原發(fā)腫瘤的體外成像和重量(n=10只小鼠)。G1–G4分別代表對照組、CFMPD+L組、BET6@CFPD+L組和BET6@CFMPD+L組。

f. 攜帶腦轉(zhuǎn)移瘤和原發(fā)腫瘤的小鼠的生存率分析(n=10只小鼠)。生存研究通過雙尾對數(shù)秩和檢驗(Mantel-Cox)進行分析。

g. 腦組織的HE染色圖像(標尺=2毫米)。

所有數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。兩組間的比較采用雙尾Student's t檢驗，多組間的比較采用單因素方差分析(ANOVA)及Tukey事后檢驗。p值<0.05視為有統(tǒng)計學意義的差異。

源數(shù)據(jù)以Source Data文件形式提供。

圖9. 體內(nèi)抗腫瘤免疫反應評估。

a. 代表性的免疫熒光圖像，用于檢測腫瘤切片中的CRT和HMGB1水平(標尺=50μm)。

b–d. LNs中CD80+ CD86+ DCs、CD8+ T細胞和CD4+ T細胞的百分比。脾臟中CD8+ T細胞(e)、中心記憶T細胞(Tcm，CD44+CD62L+)(f)和效應記憶T細胞(Tem，CD44+CD62L-)(g)的量化數(shù)據(jù)。

h. 腫瘤中IFN-γ+ CD8+ T細胞的豐富度(h)、CD4+ T細胞(i)和調(diào)節(jié)性T細胞(Treg細胞)(j)。

k. 不同治療后腫瘤中PD-L1+細胞的百分比。

l, m. 腫瘤中M1(l)和M2(m)細胞的流式細胞儀分析。

n, o. 原發(fā)腫瘤和腦轉(zhuǎn)移腫瘤小鼠的DLNs中CD8+ T細胞(n)和CD4+ T細胞(o)的流式細胞儀測量。

p, q. 不同治療后大腦中M1(p)和M2(q)細胞的百分比。

r. 代表性的免疫熒光圖像，觀察不同處理后大腦中的CD86+和CD206+細胞(標尺=1mm)。綠色和紅色熒光信號分別表示CD86和CD206。

所有實驗每組n=4只小鼠。所有數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。兩組間的比較采用雙尾Student's t檢驗，多組間的比較采用單因素方差分析(ANOVA)及Tukey事后檢驗。p值<0.05視為有統(tǒng)計學意義的差異。

源數(shù)據(jù)以Source Data文件形式提供。

圖10. E0771攜帶小鼠的抗轉(zhuǎn)移效果和抗腫瘤免疫反應。

a. 攜帶腦轉(zhuǎn)移瘤的小鼠的生物發(fā)光成像。

b. 腫瘤接種后第8、16和24天的生物發(fā)光成像半定量結果。

c, d. 原發(fā)腫瘤的體外成像和重量。

e–g. LNs中CD80+ CD86+ DCs、CD8+ T細胞和CD4+ T細胞的百分比。

h–k. 脾臟中CD80+ CD86+ DCs、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞和中心記憶T細胞(Tcm細胞)的豐富度。

l–o. 腫瘤中CD8+ T細胞、PD-L1+細胞、調(diào)節(jié)性T細胞(Treg細胞)和M1細胞的豐富度。

對于原發(fā)腫瘤生長和生物發(fā)光成像研究(a, b, d)，每組n=9只小鼠。對于其他研究，每組n=5只小鼠。

所有數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。兩組間的比較采用雙尾Student's t檢驗，多組間的比較采用單因素方差分析(ANOVA)及Tukey事后檢驗。p值<0.05視為有統(tǒng)計學意義的差異。

源數(shù)據(jù)以Source Data文件形式提供。

研究結論

我們構建了一種多功能納米藥物dBET6@CFMPD，它基于MMP-2響應肽序列自我組裝成球形納米顆粒，具有可變形狀和線粒體靶向能力，用于改善PROTAC的腫瘤特異性積聚并聯(lián)合PDT。

dBET6@CFMPD在腫瘤中積聚后，響應MMP-2轉(zhuǎn)化為納米纖維，增強Ce6的保留以改善PDT效率，并誘導強烈的ICD。

dBET6抑制腫瘤細胞的c-Myc和PD-L1表達，通過PROTAC誘導細胞凋亡。同時，dBET6可以極化TAMs至M1表型，與ICD和PD-L1下調(diào)協(xié)同作用，重塑TIME并觸發(fā)強烈的抗腫瘤免疫應答。

多功能納米藥物dBET6@CFMPD通過整合PROTAC和PDT-免疫療法，可以重塑TIME并誘導強烈的抗腫瘤免疫應答，從而抑制原發(fā)和轉(zhuǎn)移腫瘤的發(fā)展，為癌癥聯(lián)合治療提供了一種策略。