熒光素酶報告基因系統(tǒng)是一種基于熒光素酶催化底物氧化反應(yīng)產(chǎn)生生物發(fā)光的檢測技術(shù)，廣泛應(yīng)用于細胞生物學研究。其中，螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高靈敏度、寬線性檢測范圍(約7~8個數(shù)量級)以及較短的半衰期(在哺乳動物細胞中約為3小時，在植物細胞中約為3.5小時)而成為最常用的報告基因。其發(fā)光信號強度在酶濃度為10?1? mol/L至10?? mol/L的范圍內(nèi)與酶活性呈線性關(guān)系，并且在理想條件下可檢測到低至10?2? mol/L的熒光素酶活性。此外，熒光素酶報告基因系統(tǒng)具有非放射性、檢測快速、靈敏度高(比氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶CAT高100倍)等優(yōu)點，特別適用于高通量篩選和活細胞檢測。通過將熒光素酶報告基因載體轉(zhuǎn)染至宿主細胞后，可利用熒光素酶檢測系統(tǒng)靈敏且便捷地監(jiān)測基因表達水平，已成為細胞生物學研究中的重要工具。

基本信息

英文標題：Screening Multidrug Resistance Reversal Agents in Traditional Chinese Medicines by Efflux Kinetics of DLuciferin in MCF-7/DOXFluc Cells

中文標題：通過D-熒光素的外排動力學篩選傳統(tǒng)中藥中的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑

發(fā)表期刊：《ACS Omega》

影響因子：3.4

作者單位：

1.College of Pharmaceutical Sciences and Academy of Chinese Medical Science, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou, Zhejiang 311258, China

2.College of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou, Zhejiang 311258, China

作者信息：Yue Zhao,Chaoyuan Tang,Jingyi Huang

研究背景

乳腺癌是全球女性癌癥患者的主要死亡原因，而藥物耐藥性是化療失敗的關(guān)鍵因素。多藥耐藥性(MDR)主要由ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白(ABC轉(zhuǎn)運蛋白)介導，這些蛋白將化療藥物主動運出細胞，減少其細胞毒性。目前，MDR逆轉(zhuǎn)劑主要包括化學藥物如維拉帕米(Vera)，但傳統(tǒng)中藥(TCMs)也顯示出一定的MDR逆轉(zhuǎn)潛力。由于TCMs成分復雜，建立一種快速、安全、有效的體外篩選方法至關(guān)重要。本研究旨在通過D-熒光素的外排動力學，建立一種簡單快速的體外方法來篩選TCMs中的MDR逆轉(zhuǎn)劑。

研究方法

本研究建立了一種基于D-熒光素外排動力學的體外方法，用于篩選傳統(tǒng)中藥中的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑。首先，通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建了穩(wěn)定表達熒光素酶的多柔比星耐藥細胞系(MCF-7/DOXFluc)。接著，選取多種傳統(tǒng)中藥成分，利用生物發(fā)光成像(BLI)技術(shù)檢測D-熒光素在MCF-7/DOXFluc細胞中的外排動力學，評估這些中藥成分對D-熒光素外排的抑制效果。通過MTT實驗測定不同中藥成分對MCF-7/DOXFluc細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)，并記錄D-熒光素的外排曲線，計算外排動力學參數(shù)。最后，在MCF-7/DOXFluc腫瘤荷載小鼠中，評估理想逆轉(zhuǎn)劑(如槲皮素，Qu)與多柔比星(DOX)聯(lián)合使用時的抗腫瘤效果，并通過高效液相色譜(HPLC)測定腫瘤中DOX的分布。

實驗結(jié)果

圖1：展示了實驗的整體設(shè)計，包括D-熒光素作為ABC轉(zhuǎn)運蛋白底物的使用，以及MCF-7/DOXFluc細胞系的建立和應(yīng)用。

圖2：展示了不同TCMs對MCF-7/DOXFluc細胞D-熒光素外排的影響，包括IC50值的測定和D-熒光素外排曲線的繪制。結(jié)果顯示，Qu顯著增加了D-熒光素的保留。

圖3：展示了在MCF-7/DOXFluc腫瘤荷載小鼠中，Qu對D-熒光素外排的影響。BLI信號顯示，Qu顯著增加了D-熒光素在腫瘤中的保留。

圖4：展示了Qu與DOX在不同比例下對MCF-7/DOXFluc細胞的協(xié)同抑制效果，確定了最佳的聯(lián)合比例為2:1。

圖5：展示了Qu與DOX聯(lián)合使用對腫瘤體積、重量和BLI信號的影響，結(jié)果顯示聯(lián)合治療顯著抑制了腫瘤生長。

圖6：展示了DOX在腫瘤中的分布，以及Qu對DOX保留的影響。結(jié)果顯示，Qu顯著增加了DOX在腫瘤中的保留，從而在低劑量下維持了療效并減少了毒性。

研究結(jié)論

研究結(jié)果表明，槲皮素(Qu)顯著增加了MCF-7/DOXFluc細胞中D-熒光素的保留，其效果與陽性對照維拉帕米相當。體外和體內(nèi)實驗均顯示，Qu顯著抑制了D-熒光素的外排，且兩者之間具有高度一致性。此外，Qu與DOX聯(lián)合使用顯著抑制了MCF-7/DOXFluc腫瘤的生長，包括腫瘤體積和重量的減少。Qu還增加了DOX在腫瘤中的保留，從而在低劑量下維持了DOX的療效，并減少了其毒性。綜上所述，本研究提供了一種新型、高效、低成本的方法來篩選傳統(tǒng)中藥中的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑，該方法不僅適用于單體化合物，還適用于中藥復方制劑。