同源異體小鼠腫瘤模型是免疫腫瘤學(xué)(I/O)研究中不可或缺的臨床前模型，但它們對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑(ICIs)的反應(yīng)有限，這可能是由于它們的固有低免疫原性。為了解決這一問(wèn)題，研究人員通過(guò)將雞卵清蛋白(OVA)這一高度免疫原性的蛋白質(zhì)表達(dá)到同源異體腫瘤細(xì)胞中，開(kāi)發(fā)了新的免疫原性同源異體模型。這些模型，如DC2.4-OVA和B16-OVA，顯示出比它們的親本細(xì)胞系更慢的腫瘤生長(zhǎng)速度，這可能是由于免疫介導(dǎo)的排斥反應(yīng)。更重要的是，這些OVA表達(dá)的模型對(duì)ICIs，特別是抗PD-1治療，表現(xiàn)出更高的敏感性，這表明它們?cè)谠鰪?qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)方面具有潛力。此外，通過(guò)過(guò)繼T細(xì)胞轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，研究人員驗(yàn)證了這些模型中存在腫瘤特異性記憶T細(xì)胞。這些結(jié)果表明，OVA工具細(xì)胞不僅增強(qiáng)了對(duì)ICIs的反應(yīng)，而且為臨床前免疫治療評(píng)估提供了新的、具有更高免疫原性的同源異體模型，這對(duì)于I/O研究具有重要的意義。

基本信息

英文標(biāo)題：A20-OVA Nanoparticles Inhibit Allergic Asthma in a Murine Model.

中文標(biāo)題：A20-OVA納米顆粒在小鼠模型中抑制過(guò)敏性哮喘。

發(fā)表期刊：《Inflammation》

影響因子：4.5

作者單位：

1.Department of Pediatric Otolaryngology, Shenzhen Hospital, Southern Medical University, 1033 Qinghu Blvd, Shenzhen, 518101, China

2.The Research Center of Allergy & Immunology, School of Medicine, Shenzhen University, Shenzhen, China

作者信息：Xiang-Qian Luo,1 Jian-Wen Zhong,1 Shu-Yao Qiu,1 Min Zhi,1 Li-Qiang Yang,1 Yi-Long Zhou,1Fen-Xuan Zhou,1 Ping-Chang Yang,2 Da-Bo Liu,1 and Li-Hua Mo.

研究背景

在過(guò)敏性哮喘的發(fā)病機(jī)制中，Th2細(xì)胞的偏移扮演著關(guān)鍵角色，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)和調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子對(duì)于維持體內(nèi)平衡至關(guān)重要。本研究旨在探究聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)-卵清蛋白(OVA)+ A20(一種泛素E3連接酶)納米疫苗對(duì)小鼠模型中過(guò)敏性哮喘的抑制效果。研究中，A20和OVA被封裝進(jìn)PLGA中，形成納米疫苗(PLGA-OVA+A20)。通過(guò)開(kāi)發(fā)一個(gè)以O(shè)VA為特定抗原的過(guò)敏性哮喘小鼠模型，研究測(cè)試了PLGA-OVA+A20納米疫苗在維持氣道組織免疫平衡中的作用。結(jié)果表明，PLGA-OVA+A20納米疫苗通過(guò)抑制Th2炎癥反應(yīng)和促進(jìn)氣道組織中Treg細(xì)胞的生成，有效抑制了小鼠的哮喘反應(yīng)。研究結(jié)論認(rèn)為，PLGA-OVA+A20納米疫苗顯著抑制了敏感化小鼠的氣道過(guò)敏反應(yīng)，主要通過(guò)促進(jìn)Treg細(xì)胞的生成和IL-10的產(chǎn)生。這些數(shù)據(jù)表明PLGA-OVA+A20在治療過(guò)敏性哮喘方面具有潛在的轉(zhuǎn)化應(yīng)用價(jià)值。

研究方法

在實(shí)驗(yàn)中，首先制備了重組A20蛋白及其突變體，通過(guò)將A20基因構(gòu)建到PAML-C5ET載體中，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10細(xì)胞，陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒經(jīng)過(guò)KpnI和EcoRI消化后，目標(biāo)片段被連接到PET-32a載體中，并轉(zhuǎn)化到BL21中表達(dá)。接著，通過(guò)親和色譜純化A20蛋白，并使用離子交換柱和ToxinEraser Endotoxin Removal Kit去除內(nèi)毒素。制備PLGA-OVA+A20納米顆粒時(shí)，將OVA+A20與PLGA共溶于二氯甲烷和丙酮中，通過(guò)探針超聲形成初級(jí)乳液，再加入含聚乙烯醇的水溶液中形成二級(jí)乳液，經(jīng)過(guò)攪拌過(guò)夜后蒸發(fā)有機(jī)相，用蒸餾水洗滌并離心收集納米顆粒。使用動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)測(cè)定納米顆粒的大小。通過(guò)將凍干的納米顆粒溶解在含1% SDS和0.05 mol/L NaOH的水相中，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，并通過(guò)透析袋收集釋放的蛋白質(zhì)量。在誘導(dǎo)過(guò)敏性氣道炎癥方面，使用雌性BALB/c小鼠，通過(guò)腹腔注射OVA和氫氧化鋁混合物進(jìn)行致敏，然后用含有OVA、A20和OVA+A20的鼻滴處理小鼠7天，通過(guò)吸入不同濃度的甲酰膽堿測(cè)量氣道阻力，并在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)收集肺組織和支氣管肺泡灌洗液(BALF)進(jìn)行分析。使用ELISA試劑盒測(cè)定培養(yǎng)上清和BALF中的細(xì)胞因子水平。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析脾細(xì)胞和T細(xì)胞的增殖，其中脾細(xì)胞用APC-CD4、FITC-CD25和PE-Foxp3抗體標(biāo)記，而T細(xì)胞則用CFSE標(biāo)記后與樹(shù)突狀細(xì)胞共培養(yǎng)。最后，通過(guò)Student’s t test和ANOVA進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，以p值小于0.05作為顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1. 本研究涉及A20基因的克隆、表達(dá)和純化。

首先，通過(guò)限制性酶切分析確認(rèn)了重組hyastatin-pET-28a(+)質(zhì)粒(含有A20 DNA)的成功構(gòu)建。接著，利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)A20蛋白，并通過(guò)蛋白質(zhì)印跡顯示A20為可溶性蛋白。具體來(lái)說(shuō)，1號(hào)樣本為誘導(dǎo)前，2號(hào)樣本為誘導(dǎo)后，3號(hào)樣本為超聲破碎后的上清液，4號(hào)樣本為超聲破碎后的沉淀物。進(jìn)一步地，通過(guò)純化步驟得到了A20蛋白及其突變體(mA20)，并使用分子標(biāo)記(MW)進(jìn)行了驗(yàn)證。最后，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)評(píng)估了A20的生物活性，結(jié)果顯示了A20的活性，數(shù)據(jù)代表了三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

圖2. 在這項(xiàng)研究中，我們探討了OVA+A20對(duì)小鼠哮喘癥狀的影響。

每組6只哮喘模型小鼠接受了圖中X軸所示的不同處理程序。研究結(jié)果包括：a) 小鼠對(duì)甲酰膽堿吸入反應(yīng)的氣道阻力記錄;b) 支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù);c) BALF中的Th2細(xì)胞因子水平;d) 血清中針對(duì)OVA的特異性IgE水平;e) 代表性的肺組織病理學(xué)圖像(放大200倍)。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式呈現(xiàn)。統(tǒng)計(jì)分析采用ANOVA加Dunnett’s檢驗(yàn)，*p < 0.001表示與OVA組相比有顯著性差異。

圖3. 在本研究中，作者對(duì)OVA+A20負(fù)載的PLGA納米粒子進(jìn)行了特性分析。

首先，通過(guò)場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(FESEM)觀察了納米粒子的形態(tài)，得到了清晰的圖像。其次，利用動(dòng)態(tài)光散射光譜(DLS)技術(shù)測(cè)定了納米粒子的尺寸分布，這是一種通過(guò)測(cè)量光強(qiáng)波動(dòng)來(lái)確定懸浮液中小顆?；蛉芤褐芯酆衔锍叽绶植嫉姆椒?。最后，評(píng)估了OVA+A20負(fù)載的PLGA納米粒子的體外累積蛋白釋放效率，這涉及到將納米粒子溶解并透析，隨后通過(guò)BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，以了解蛋白的釋放情況。這些結(jié)果為作者提供了納米粒子的詳細(xì)特性，包括形態(tài)、尺寸和蛋白釋放效率。

圖4. 在本研究中，作者探究了納米疫苗在過(guò)敏性哮喘小鼠模型中的治療效果。

小鼠接受了如圖X軸所示的不同處理程序。研究結(jié)果包括：a) 通過(guò)ELISA檢測(cè)的小鼠血清中針對(duì)OVA的特異性IgE水平;b) 支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù);c) 對(duì)甲酰膽堿吸入反應(yīng)的氣道阻力;d) 代表性的肺組織組織學(xué)圖像(放大200倍)。柱狀圖的數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式呈現(xiàn)。統(tǒng)計(jì)分析采用ANOVA加Dunnett’s檢驗(yàn)，*表示與未處理小鼠組(na?ve mouse group)相比，p值小于0.01;#表示與OVA+A20組相比，p值小于0.05。這些數(shù)據(jù)代表了六次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

圖5. 在本研究中，作者評(píng)估了氣道黏膜調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的數(shù)量及其免疫調(diào)節(jié)功能。

從正常小鼠和哮喘小鼠的氣道組織中制備單個(gè)細(xì)胞，并通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。a) 篩選的點(diǎn)圖顯示CD4+ T細(xì)胞;b) 篩選的點(diǎn)圖顯示Treg細(xì)胞的頻率;c) 條形圖顯示氣道組織中Treg細(xì)胞的總結(jié)數(shù)量;d) 在b面板篩選的細(xì)胞中，直方圖顯示IL-10+ T細(xì)胞;e) 條形圖顯示d面板中總結(jié)的IL-10+ Treg細(xì)胞數(shù)量。f, g) 通過(guò)流式細(xì)胞分選系統(tǒng)(FCSS)，從氣道組織單個(gè)細(xì)胞中分離出CD4+ CD25+ CD127? Treg細(xì)胞;從哮喘小鼠脾臟中分離出CD4+ CD25?效應(yīng)T細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)。效應(yīng)T細(xì)胞用CFSE標(biāo)記，并與Treg細(xì)胞(Treg細(xì)胞來(lái)源在每個(gè)子面板上方顯示)以5×103 : 1×103的比例共培養(yǎng)，每孔在OVA(或BSA)和DCs存在下。三天后，通過(guò)流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞。f) 篩選的直方圖顯示增殖效應(yīng)細(xì)胞的頻率。g) 條形圖顯示增殖效應(yīng)細(xì)胞的頻率。條形圖的數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式呈現(xiàn)。統(tǒng)計(jì)分析采用ANOVA加Dunnett’s檢驗(yàn)，*表示與“a”組(b和e)或“d”組(g)相比，p值小于0.01。這些數(shù)據(jù)代表了六次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

研究結(jié)論

作者克隆并表達(dá)了A20蛋白，并在OVA致敏的BALB/c小鼠模型中測(cè)試了A20或OVA+A20治療對(duì)氣道炎癥的影響。結(jié)果顯示OVA+A20能有效抑制哮喘反應(yīng)，而單獨(dú)A20治療效果有限。利用PLGA納米顆粒作為載體，作者制備了OVA+A20納米疫苗，這些納米顆粒能在96小時(shí)內(nèi)完全釋放載荷。納米疫苗在降低哮喘小鼠的血清特異性IgE水平、BALF中的炎癥細(xì)胞數(shù)和氣道阻力方面效果顯著。此外，納米疫苗還能增加氣道組織中的IL-10+ Treg細(xì)胞生成，這些Treg細(xì)胞具有抑制效應(yīng)T細(xì)胞增殖的能力。