爬片是一種將細(xì)胞培養(yǎng)在玻璃或塑料表面上，使其附著并擴(kuò)展的技術(shù)。一般是讓玻片浸在細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)，使細(xì)胞在玻片上生長。這種技術(shù)可以用于觀察細(xì)胞形態(tài)、運動、細(xì)胞與細(xì)胞之間相互作用等。利用細(xì)胞爬片進(jìn)行體外實驗可排除體內(nèi)諸多干擾因素的影響，方便對細(xì)胞進(jìn)行各種干預(yù)處理。

在做免疫熒光(IF)，激光共聚焦(Confocal)，凋亡檢測(TUNEL)時，免不了要制備細(xì)胞爬片，爬片質(zhì)量決定了最后拍照的質(zhì)量以及實驗數(shù)據(jù)的精準(zhǔn)性。今日為大家整理了細(xì)胞進(jìn)行爬片固定制作步驟及注意事項，幫助您快速上手開展實驗。

細(xì)胞爬片固定實驗步驟及注意事項

細(xì)胞爬片準(zhǔn)備

1.爬片可用一般的蓋玻片，也可用專用爬片；

2.將蓋玻片剪裁成合適的大小，以備置于6孔板、12孔板或24孔板;裁剪時用小沙輪輕劃一下，稍用力掰開。如接種大皿，請不要將蓋玻片切開，直接清潔后放入培養(yǎng)皿中，待染色時再切開，這樣既保證了細(xì)胞均一性，又可同時做多個指標(biāo)的染色。

3.將剪裁好的爬片，置于濃硫酸中浸泡過夜，次日用自來水沖20遍，置于無水j精中浸泡6小時，再用三蒸水沖洗3遍(主要目的是將酸沖洗干凈，以免影響細(xì)胞貼壁效果)，置于玻璃培養(yǎng)皿中烘干后進(jìn)行高壓消毒。

4.高壓消毒后取出放入烤箱中烤干，放入超凈臺備用。

細(xì)胞爬片制作

1.胰酶消化細(xì)胞后，計數(shù)重懸細(xì)胞于完全培養(yǎng)基中。

2.根據(jù)玻片的大小加入細(xì)胞，向每孔中預(yù)留的放置爬片的位置處滴少量培養(yǎng)基，目的是使玻片與培養(yǎng)皿粘合到一起，然后放入玻片，防止加細(xì)胞懸液時玻片漂起，造成雙層細(xì)胞貼片。整個過程注意無菌操作。

3.根據(jù)需要選擇合適的細(xì)胞密度種入培養(yǎng)板內(nèi)即可

4.待細(xì)胞貼壁后，去上清，加含藥培養(yǎng)基。

5.按照實驗設(shè)計，一段時間后取出玻片。取玻片時，將注射器針尖向背面彎曲，將爬片輕輕勾起，用小鑷子取出。

6.將所需數(shù)量的爬片取出時，應(yīng)用酒精燈火焰燒一下針頭和鑷子。末取出的可繼續(xù)培養(yǎng)。

細(xì)胞爬片固定

1.細(xì)胞爬片取出后，用PBS洗2遍再做固定(此步驟可根據(jù)研究目的做取舍，比如做凋亡細(xì)胞染色時可免洗，凋亡的細(xì)胞在清洗的過程中有可能脫落)。

2.用培養(yǎng)皿保存細(xì)胞爬片。在皿底放一層面巾紙，再放爬片，(方便取片)。然后蓋上蓋子，做好標(biāo)記，用透明膠帶將蓋子和皿連在一起，-20℃保存。

3.放-20℃保存之前，吸干培養(yǎng)基或PBS，-20℃保存2-3個月的片子做免疫組化是沒有問題的。

細(xì)胞爬片常用的固定液

1.冷丙酮：可用于一般的免疫組化染色。

將純的丙酮預(yù)先放入冰箱-20℃后便為冷丙酮(放心，丙酮在此溫度不會為固體的)細(xì)胞爬片取出后，PBS洗2遍，便可加入冷丙酮于-20℃(丙酮有很強(qiáng)的揮發(fā)性，注意將含有丙酮和爬片的器皿蓋嚴(yán)，防止其揮發(fā))固定10分鐘。取出后，室溫吹干，然后放入-20℃保存。

2.多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫電鏡;也可用于免疫熒光以及TUNEL染色。

主要檢測組織內(nèi)一些性能嬌弱的抗原特別是細(xì)胞表面抗原，例如各類淋巴細(xì)胞分化決定簇(CD)、主要組織相容性抗原等。

室溫固定15分鐘后，將表面液體吹干，-20℃保存

3. 95%乙醇，可用于免疫組化。

優(yōu)點：穿透性強(qiáng)、抗原性保存較好。

缺點：但醇類對低分子蛋白質(zhì)、多肽及胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)保存效果較差，使蛋白變性的作用輕，固定后可再溶解;染色過程中，溫育時間膠長，抗原會流失而減弱反應(yīng)強(qiáng)度。

室溫固定15分鐘后，將表面液體吹干，-20℃保存

4. 甲醛(福爾馬林)

優(yōu)點：形態(tài)結(jié)構(gòu)保存好，且穿透性強(qiáng)，

缺點：甲醛放置過久可氧化為甲酸，使溶液pH降低，影響染色;分子間交聯(lián)形成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可能部分或完全掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露。可造成假陰性的染色結(jié)果。

以多聚甲醛為例進(jìn)行固定

1.準(zhǔn)備4%多聚甲醛(PFA)，于4℃冰箱中保存，使用時常溫復(fù)溫。

2.在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的爬片用PBS浸洗3次，每次3 min，輕輕晃動，避免將細(xì)胞沖掉。

3.用4%的多聚甲醛固定爬片15 min(細(xì)胞自帶熒光時注意避光)，PBS浸洗爬片3次，每次3 min。

4.Triton X-100(PBS配制，濃度根據(jù)實驗調(diào)整)室溫通透20 min。

5.PBS浸洗爬片3次，每次3 min。

6.按實驗需求進(jìn)行后續(xù)實驗。

細(xì)胞爬片封片

封片前根據(jù)實驗需求決定是否需要孵育抗體或復(fù)染核。孵育好后用PBS浸洗3次，用吸水紙吸干爬片上的液體，封片液封片。

細(xì)胞爬片注意事項

固定好的細(xì)胞爬片建議盡快用于實驗，以免影響實驗效果。

取爬片時注意控制力度，夾取時盡量夾取爬片邊緣，以免夾破爬片或造成劃痕。

細(xì)胞爬片取出后，一般用PBS潤洗3遍(潤洗操作盡量輕柔，以免細(xì)胞脫壁;根據(jù)研究目的，可調(diào)整潤洗次數(shù)，避免細(xì)胞脫壁)，然后做固定。

對于貼壁性較差的細(xì)胞，可提前用包被液(明膠，多聚賴氨酸，鼠尾膠原等)包被爬片。

如果細(xì)胞帶有熒光標(biāo)記，所有操作步驟盡量在較暗處進(jìn)行。

使用細(xì)胞爬片時(比如在六孔板中放入爬片，六孔板的孔底面積往往會比爬片面積多出一部分，加細(xì)胞懸液時常常就是細(xì)胞鋪滿整個孔底，有時細(xì)胞生長邊集現(xiàn)象，就是靠近壁邊緣密度要高些，這樣處于中央玻片上爬的細(xì)胞數(shù)量就可能相對較少)。比較好的做法是將玻片放入孔板的孔內(nèi)后，加細(xì)胞懸液時只滴到玻片上，一直滴到液體布滿整個玻片又不會溢出玻片邊緣。

按照實驗設(shè)計，作用一定時間后取玻片。注意細(xì)胞不能太密，否則容易掉片。