污染是細(xì)胞培養(yǎng)中一個(gè)大敵，一旦污染，前功盡棄。 決定要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，首先-定要有強(qiáng)烈的無菌意識(shí)，操作中要遵守嚴(yán)格的操作規(guī)程，不要怕麻煩，越細(xì)心越好。

一般情況下，如果你的細(xì)胞被細(xì)菌污染了，培養(yǎng)皿或瓶中的細(xì)胞狀態(tài)很快就會(huì)發(fā)生變化，表現(xiàn)為胞漿中出現(xiàn)大量的顆粒，液體渾濁、培養(yǎng)基PH下降，變成黃色，貼壁細(xì)胞形態(tài)變圓、會(huì)脫壁死亡;而受到真菌污染的細(xì)胞，細(xì)胞狀態(tài)并不會(huì)馬上發(fā)生變化，培養(yǎng)3-4天后，可能才會(huì)在培養(yǎng)皿中看到白色的漂浮物或者黑色的小點(diǎn)兒。

常見細(xì)胞培養(yǎng)污染判別

真菌污染

真菌種類多，形態(tài)各異，但污染后均不難發(fā)現(xiàn)，大多呈白色或淺黃色小點(diǎn)漂浮于培養(yǎng)液表面，肉眼可見;有的散在生長，鏡下觀察呈絲狀、管狀或樹枝狀菌絲，縱橫交錯(cuò)穿行于細(xì)胞之間。念珠菌和酵母菌呈卵圓形態(tài)，散在于細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間生長。

細(xì)菌污染

污染后大多能改變培養(yǎng)液pH培養(yǎng)液變混濁，毒性大的細(xì)菌很快導(dǎo)致細(xì)胞崩解死亡。加用抗生素的培養(yǎng)用液一般可預(yù)防和排除個(gè)別少量細(xì)菌的污染。細(xì)菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細(xì)沙狀，根據(jù)感染細(xì)菌的不同，可有不同的外形，培養(yǎng)液一般會(huì)渾濁變黃，對細(xì)胞生長影響明顯。

支原體污染

支原體(Mycoplasma)是一種沒有細(xì)胞壁的原核生物，大小約0.3-0.8微米。目前，已發(fā)現(xiàn)的支原體品種有100多種。

細(xì)胞培養(yǎng)的支原體污染來源主要有

(1)細(xì)胞之間的交叉污染，這是支原體污染的最主要原因;

(2)細(xì)胞培養(yǎng)操作人員的口腔、皮膚等;

(3)細(xì)胞培養(yǎng)用的組分，如血清、培養(yǎng)液等;

黑膠蟲污染

黑膠蟲可以穿透濾膜，也可以通過空氣傳播，低倍下為黑色點(diǎn)狀，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去，培養(yǎng)液也是不渾的，一般不會(huì)太影響，細(xì)胞還是可以用的。常常是細(xì)胞生長狀態(tài)良好，且觀測到的運(yùn)動(dòng)物無明顯增多，且培養(yǎng)液顏色、透明度無明顯變化，可在同一批號(hào)的血清養(yǎng)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。

常見細(xì)胞培養(yǎng)污染判別及應(yīng)對措施

細(xì)胞培養(yǎng)中的常見污染主要包括：細(xì)菌、霉菌、支原體、黑膠蟲、病毒和交叉污染等，每一種污染都有各自的特點(diǎn)。如細(xì)菌和霉菌增殖迅速，短時(shí)間就對細(xì)胞造成明顯傷害;而支原體和病毒對細(xì)胞的影響則是一種緩慢長期的過程。下面就具體看看每一種污染。

1. 細(xì)菌污染(較容易被發(fā)現(xiàn))

引起原因：操作不規(guī)范或無菌措施不到位等;

細(xì)菌污染種類：白色葡萄球菌，大腸桿菌，假單孢菌、枯草桿菌等;

細(xì)胞污染后的變化

①污染后由于有大量酸性物質(zhì)產(chǎn)生，因此培養(yǎng)基會(huì)短時(shí)間內(nèi)由紅色變?yōu)辄S色;

②由于細(xì)菌大量增殖，培養(yǎng)基變渾濁，稍微振蕩后可見培養(yǎng)基表面有漂浮物;

③普通倒置顯微鏡高倍鏡觀察，胞漿內(nèi)可見大量顆粒(如下圖紅色箭頭);

④細(xì)胞生長緩慢，逐漸變圓脫落。

如下圖所示：左：懸浮細(xì)胞污染后，可見懸浮細(xì)胞個(gè)體遠(yuǎn)大于桿狀細(xì)菌，而細(xì)菌呈黑色顆粒狀并會(huì)有較快的運(yùn)動(dòng)速度;右：貼壁細(xì)胞，可看到球狀細(xì)菌分布于細(xì)胞周圍并做劇烈運(yùn)動(dòng)。

細(xì)菌污染的細(xì)胞(左懸浮細(xì)胞，右貼壁細(xì)胞)

處理措施

在培養(yǎng)液中添加雙抗(P/S)處理;可用抗生素的常用量的5~10倍作沖擊療法，用藥24~48h后再換常規(guī)培養(yǎng)液;

另外添加西司他丁鈉和亞胺培南(泰能)處理細(xì)胞，適用于培養(yǎng)用具被打翻、使用了污染的培養(yǎng)液或要培養(yǎng)污染的組織或者凍存細(xì)胞的污染情況[1]。

裸鼠體內(nèi)接種法是比較有效和徹底的除菌方法。主要包括腹水接種和皮下荷瘤分離細(xì)胞。既能徹底清除污染細(xì)菌，又能保持腫瘤細(xì)胞的來源特征和惡性特性。對于一些特別珍貴的腫瘤細(xì)胞，可采用裸鼠體內(nèi)接種法[2]。

2. 霉菌污染(較容易被發(fā)現(xiàn))

引起原因：操作不規(guī)范或無菌措施不到位等;

污染種類：白色念珠菌，酵母菌，黑霉菌，曲霉菌，孢子菌等;

細(xì)胞污染后的變化

①一般來說，培養(yǎng)液不會(huì)變渾濁;

②比較容易發(fā)現(xiàn)，肉眼可見點(diǎn)狀菌落(淡黃色或者白色)漂浮在培養(yǎng)基表面(如下圖左);

③普通倒置顯微鏡下觀察，可見絮狀交錯(cuò)的菌絲或菌團(tuán)生長在細(xì)胞之間;有時(shí)真菌并不是直接分布于細(xì)胞貼壁層，需要通過調(diào)整顯微鏡仔細(xì)觀察尋找菌絲或菌團(tuán)(如下圖右)。

如下圖所示：懸浮細(xì)胞U397的霉菌污染，黃色圓形發(fā)亮的是U397;紅色箭頭：霉菌的菌絲和孢子囊，特別的是孢子釋放出來后是難以被酒精殺死。

霉菌污染后的懸浮細(xì)胞

處理措施

添加制霉菌素和兩性霉素B，但是對細(xì)胞的毒性也較大;

環(huán)境徹底消毒：先后用酒精、新潔爾擦洗培養(yǎng)箱;水盤加上飽和量的硫酸銅。

若細(xì)胞不是特別珍貴，建議丟棄。

3. 支原體污染(難被發(fā)現(xiàn))

支原體是一種自然界中能獨(dú)立生活的最小微生物，能通過細(xì)菌濾器，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，支原體感染發(fā)生率很高[3]。由于支原體可以與細(xì)胞共存，生長速率受影響較小，而被忽視。支原體污染在細(xì)胞培養(yǎng)污染中最為隱蔽和最難察覺，但是支原體能明顯影響宿主細(xì)胞代謝、RNA合成及基因表達(dá)的作用，因此越來越受到重視。

引起原因：主要來源于是已感染支原體細(xì)胞之間的交叉污染，支原體感染的血清和胰酶等;

細(xì)胞污染后的變化

①培養(yǎng)液不變渾濁，但會(huì)很快變成黃色;

②多數(shù)細(xì)胞在形態(tài)方面少有明顯變化;

③在倒置顯微鏡下可見胞漿出現(xiàn)小顆?；蚩张?

如下圖：支原體個(gè)體很小，需要使用透射電鏡才能清晰看到其結(jié)構(gòu)及分布，圖中紅色箭頭即為支原體，其分布在細(xì)胞周圍。

支原體污染后的透射電鏡圖[4]

處理措施

定期用支原體試劑盒檢測;

換液可以減緩污染情況，但無法根除;

支原體清除試劑盒可以達(dá)到較好效果;

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞清除法。

4. 黑膠蟲污染

引起原因：往往來源于血清;

細(xì)胞污染后的變化

①低倍鏡下觀察時(shí)可見黑色小點(diǎn)，高倍鏡下可見到其做布朗運(yùn)動(dòng)，像小蟲游來游去;

②細(xì)胞培養(yǎng)液仍然清亮，污染較輕時(shí)對細(xì)胞無影響;若太多就會(huì)對細(xì)胞造成影響。

如下圖：紅色箭頭所示黑膠蟲分布于細(xì)胞間。

黑膠蟲污染后的細(xì)胞[5]

處理措施

更換血清;增加細(xì)胞密度，提高細(xì)胞的生長率。

5. 病毒污染

引起原因：病毒可能來自于血清;

細(xì)胞污染后的變化

①污染后培養(yǎng)液無明顯變化;

②大部分細(xì)胞也不會(huì)有明顯的形態(tài)變化;

6. 交叉污染

引起原因：兩種或兩種細(xì)胞以上的實(shí)驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)器具、試劑等混用而易造成的污染;

檢測手段：可通過鏡檢觀察細(xì)胞形態(tài)是否與所培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)一致來判斷，另外還可以通過各種免疫學(xué)試驗(yàn)、同功酶分析及細(xì)胞遺傳學(xué)方法來確定。

處理方式：針對病毒和交叉污染較難清除，建議丟棄細(xì)胞重新培養(yǎng);

看到這里，文章開頭的那幾張圖片代表著什么污染，你能辨別了嗎?可以在下方給我們留言，看看你是否掌握了這項(xiàng)技能哦!

學(xué)會(huì)對各種污染情況的辨別和處理是一項(xiàng)不可或缺的實(shí)驗(yàn)技能，希望大家在看完我們的文章后結(jié)合你的實(shí)驗(yàn)操作，學(xué)會(huì)如何應(yīng)對細(xì)胞污染。

參考文獻(xiàn)

1.江千里, 王健民, 江汕,等. 西司他丁鈉+亞胺培南消除細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)菌污染的研究[J]. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 25(1):114-115.

2.王鴻、張偉、孟娜. 細(xì)胞培養(yǎng)中珍貴貼壁細(xì)胞污染挽救方法的評價(jià)[J]. 首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2011,26 (1):1006-7795.

3.Olareringeorge A O, Hogenesch J B. Assessing the prevalence of mycoplasma contamination in cell culture via a survey of NCBI's RNA-seq archive[J]. Nucleic Acids Research, 2015, 43(5): 2535-2542.

4.Shlomo R, Nechama S K, Jonathan D K,. Contamination of Tissue Cultures by Mycoplasmas. DOI: 10.5772/51518

5.辛顏彬.細(xì)胞培養(yǎng)污染的發(fā)生、預(yù)防及清除[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，1989，13( 6):468-470.