許多科研小伙伴在第一次接觸到細(xì)胞培養(yǎng)傳代時(shí)，可能會(huì)遇到一些問(wèn)題，導(dǎo)致手忙腳亂，為此，我們特定收集整理匯總一些新手們?cè)诩?xì)胞培養(yǎng)傳代常見(jiàn)問(wèn)題及相應(yīng)解決方案，希望能幫助到大家。

細(xì)胞培養(yǎng)傳代過(guò)程中碰到的問(wèn)題及解決方法

1.一般拿到細(xì)胞后，應(yīng)該注意什么

收到細(xì)胞先不開(kāi)蓋,用酒精將整個(gè)細(xì)胞瓶外壁進(jìn)行消毒，放在培養(yǎng)箱靜置若干小時(shí)后(看細(xì)胞密度而定)在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照(建議收細(xì)胞時(shí)的培養(yǎng)基拍一張照片，觀察培養(yǎng)基的顏色和是否有漏液情況，顯微鏡下拍細(xì)胞100X，200X各兩張)，排除細(xì)胞本身污染的情況。

2.何時(shí)須更換培養(yǎng)基

視細(xì)胞生長(zhǎng)密度而定，常規(guī)細(xì)胞2-3天更換培養(yǎng)基。

3.細(xì)胞何時(shí)進(jìn)行傳代較好

一般情況下細(xì)胞生長(zhǎng)至完全匯合后就應(yīng)該傳代，所有細(xì)胞生長(zhǎng)都有一個(gè)要求不宜生長(zhǎng)過(guò)密(也就是常說(shuō)的長(zhǎng)老了)，但有接觸抑制的細(xì)胞，在匯合前就必須進(jìn)行傳代，這類細(xì)胞一般在密度70-80%就進(jìn)行傳代，否則會(huì)引起細(xì)胞分化。

4.貼壁細(xì)胞如何進(jìn)行傳代

去掉原T25培養(yǎng)瓶里面的培養(yǎng)基，T25瓶加3-4 ml PBS洗1-2次;棄PBS，再加1.5 ml的Trypsin-EDTA (1X)消化液消化細(xì)胞，顯微鏡下觀察，待細(xì)胞變圓，細(xì)胞間隙明顯，部分細(xì)胞剛開(kāi)始脫離瓶壁，加4 ml左右完全培養(yǎng)液混勻終止消化，將細(xì)胞小心吹打下來(lái)，1000 rpm/min室溫離心5min;棄上清，細(xì)胞沉淀用完全培養(yǎng)液重懸，按要求分瓶(視細(xì)胞密度而定1:2-1:3，1:3-1:6，1:6-1:8)，每T25瓶補(bǔ)足培養(yǎng)基至5-6 ml，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。

5.懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何傳代處理

一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中，稀釋細(xì)胞濃度即可，若培養(yǎng)液太多時(shí)，將細(xì)胞懸液移入離心管中，1000 rpm/min 室溫離心5 min。棄上清，細(xì)胞沉淀用完全培養(yǎng)液重懸，按要求分瓶(視細(xì)胞密度而定1:4-1:8)，每T25瓶加完全培養(yǎng)液至4-5 ml，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。有些懸浮細(xì)胞趨于成團(tuán)生長(zhǎng)，此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，當(dāng)補(bǔ)液時(shí)，需避免反復(fù)吹打。

6.貼壁細(xì)胞傳代如何使用胰酶

一般使用trypsin-EDTA濃度為0.25% trypsin-0.53 mM EDTA.2Na或0.05%trypsin-0.02 mM EDTA.2Na。消化液濃度過(guò)高時(shí)，易造成培養(yǎng)基中細(xì)胞碎片增多，黑渣子增多，常規(guī)細(xì)胞傳代時(shí)建議用0.05%的胰酶進(jìn)行消化，對(duì)于難消化的細(xì)胞可采用0.25%胰酶進(jìn)行消化，細(xì)胞密度過(guò)高超過(guò)80%時(shí)，采用分步消化法。胰酶儲(chǔ)存在–20°C，解凍在4°C進(jìn)行，第一次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中，保存于–20°C，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin之活性降低，并可減少污染之機(jī)會(huì)。

7.如何控制胰酶消化時(shí)間

胰酶消化的程度是細(xì)胞培養(yǎng)中的一個(gè)關(guān)鍵步驟：消化過(guò)度細(xì)胞碎片增多，黑渣子增多，細(xì)胞會(huì)成片脫落，嚴(yán)重影響細(xì)胞活性，并有部分細(xì)胞漂浮，隨棄去的胰酶流失;消化不足則細(xì)胞難于從瓶壁上吹下，反復(fù)吹打同樣也會(huì)損傷細(xì)胞活性。

不同細(xì)胞對(duì)消化液的敏感性不同，胰酶消化的時(shí)間也會(huì)有差異。胰酶消化時(shí)間與胰酶的濃度，是否含EDTA，胰酶的儲(chǔ)存時(shí)間，胰酶的儲(chǔ)存溫度，是否反復(fù)凍融，消化加入的胰酶體積，消化溫度及細(xì)胞的密度有關(guān)。消化對(duì)于新購(gòu)買(mǎi)的細(xì)胞，建議客戶先用低濃度的胰酶仔細(xì)去摸索一下消化時(shí)間，可每隔1分鐘鏡下觀察細(xì)胞是否變圓，記錄最佳消化時(shí)間，下一次操作參考之前的記錄來(lái)控制時(shí)間即可。

8.細(xì)胞離心下來(lái)的離心速率應(yīng)為多少

細(xì)胞傳代或凍存時(shí)欲回收細(xì)胞，其離心速度一般為800-1000 rpm/min，室溫離心5-8分鐘，轉(zhuǎn)速過(guò)高，將造成細(xì)胞破裂死亡。

9.如何區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞

顯微鏡下觀察：活細(xì)胞中間透亮，飽滿，有光澤，死細(xì)胞較暗。也可以通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色來(lái)計(jì)算細(xì)胞活力。

10.如何用臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞

用無(wú)血清培養(yǎng)基把細(xì)胞懸液稀釋到200～2000 個(gè)/毫升，在0.1 毫升的細(xì)胞懸液中加入0.1 毫升的0.4%的臺(tái)盼蘭溶液。輕輕混勻，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞。活細(xì)胞排斥臺(tái)盼蘭，因而染成藍(lán)色的細(xì)胞是死細(xì)胞，注意計(jì)數(shù)需在加入臺(tái)盼藍(lán)10min內(nèi)完成。有細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的，可直接用計(jì)數(shù)儀進(jìn)行。

11.二價(jià)離子抑制胰蛋白酶活性嗎

二價(jià)離子的確抑制胰蛋白酶活性。

12.使用胰蛋白酶加入EDTA是為什么

EDTA用來(lái)螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用EDTA清洗細(xì)胞，以消除來(lái)自培養(yǎng)基中所有的二價(jià)離子。

13.可否使用與原先不同的培養(yǎng)基

不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基，細(xì)胞大都無(wú)法立即適應(yīng)，易造成細(xì)胞狀態(tài)不好，最終造成細(xì)胞無(wú)法存活。

14.可否使用與原先不同的血清種類

不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，所以血清的種類和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生極大的影響。來(lái)自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無(wú)法存活。

15.細(xì)胞為何生長(zhǎng)不均勻

細(xì)胞傳代后放入培養(yǎng)箱沒(méi)有搖勻，或者放入時(shí)搖勻，但在細(xì)胞貼壁前，又移動(dòng)了培養(yǎng)瓶，頻繁開(kāi)關(guān)培養(yǎng)箱引起的振動(dòng)或者培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液過(guò)少，培養(yǎng)箱擱板表面不平整，這些因素會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)不均勻。

16.購(gòu)買(mǎi)的細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳

研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳，常見(jiàn)原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳。運(yùn)輸過(guò)程對(duì)細(xì)胞有嚴(yán)重影響。解凍過(guò)程錯(cuò)誤。冷凍細(xì)胞解凍后，加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤。細(xì)胞置于–80°C太久。

17.細(xì)胞抱團(tuán)怎么處理

一些懸浮細(xì)胞抱團(tuán)生長(zhǎng)是正常現(xiàn)象，大部分懸浮細(xì)胞在細(xì)胞密度很高的情況下，很可能會(huì)出現(xiàn)部分細(xì)胞抱團(tuán)生長(zhǎng)的現(xiàn)象，聚團(tuán)細(xì)胞很容易死亡并演化成絮狀物，殃及周?chē)膽腋〖?xì)胞，因此在培養(yǎng)懸浮細(xì)胞時(shí)需控制好細(xì)胞密度。如果出現(xiàn)了細(xì)胞團(tuán)，可以通過(guò)細(xì)胞篩去掉部分較大的細(xì)胞團(tuán)，也可以嘗試一下方法：將細(xì)胞懸液收集到15 ml離心管中，靜置20 min左右，小心取上層細(xì)胞上清培養(yǎng)(該方法只能去除部分較大的細(xì)胞團(tuán))。

18.細(xì)胞內(nèi)有空泡，是否是正常現(xiàn)象

部分細(xì)胞本身存在一定的空泡(如HepG2，Ishikawa及一些耐藥株等)，這個(gè)是正?，F(xiàn)象。如果只有少數(shù)細(xì)胞有內(nèi)出現(xiàn)極少空泡，則很可能是細(xì)胞狀態(tài)不佳，可以通過(guò)調(diào)整血清濃度，控制消化，控制傳代比例及時(shí)間等方法來(lái)調(diào)整細(xì)胞狀態(tài);如果大部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡，且單個(gè)細(xì)胞內(nèi)空泡數(shù)目偏多，則可能細(xì)胞代次較高，細(xì)胞老化所致，需更換代次較早的細(xì)胞。

19.細(xì)胞傳兩代后開(kāi)始逐漸死亡的原因

很可能是培養(yǎng)體系不適合細(xì)胞(未使用推薦的培養(yǎng)體系);或者消化過(guò)度，對(duì)細(xì)胞有嚴(yán)重影響;或者是傳代比例不合適(具有密度依賴性的細(xì)胞，傳代太稀;或者生長(zhǎng)較快的細(xì)胞，傳代較密，細(xì)胞嚴(yán)重堆疊生長(zhǎng))。

20.細(xì)胞生長(zhǎng)速度緩慢是什么原因

細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)慢有很多原因，其主要原因如下：

1)細(xì)胞的傳代次數(shù)太多，所以獲得一個(gè)新的、亞培養(yǎng)次數(shù)較少的細(xì)胞儲(chǔ)存液很有必要

2)未選擇合適的細(xì)胞收獲時(shí)機(jī)

在使用新的細(xì)胞儲(chǔ)存液的同時(shí)，也要把我好適宜的細(xì)胞收獲時(shí)機(jī)，一般在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的后期是細(xì)胞收獲時(shí)間當(dāng)細(xì)胞達(dá)到100%融合后，由于生長(zhǎng)過(guò)于擁擠，會(huì)逐漸進(jìn)入緩慢生長(zhǎng)階段，此時(shí)，細(xì)胞的活躍度也會(huì)隨之下降。

培養(yǎng)基、血清、緩沖液等質(zhì)量差，或者配方不合理。培養(yǎng)基、血清等培養(yǎng)物質(zhì)是細(xì)胞生長(zhǎng)的主要營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，所以其質(zhì)量直接會(huì)影響到細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。所以高質(zhì)量的培養(yǎng)基及合理的試劑配方維持細(xì)胞的良好生長(zhǎng)具有決定的作用。

3)CO2濃度與緩沖系統(tǒng)需求不匹配，導(dǎo)致pH控制不足

一般來(lái)說(shuō)，細(xì)胞培養(yǎng)液中緩沖液中NaHCO3的濃度與CO2濃度成正比例關(guān)系。緩沖液中NaHCO3 的濃度高，所需求的CO2濃度也較高;這樣才能達(dá)到PH平衡。

4)微生物污染，尤其是支原體

及時(shí)檢查污染，防止微生物污染，做好支原體、器皿、環(huán)境消毒、支原體清除等工作。

5)培養(yǎng)物光敏降解產(chǎn)生細(xì)胞毒性物質(zhì)

如果培養(yǎng)基長(zhǎng)時(shí)間暴露于熒光將會(huì)導(dǎo)致光敏感培養(yǎng)基組分轉(zhuǎn)化成細(xì)胞毒性自由基和H2O2，從而影響到細(xì)胞生長(zhǎng)甚至細(xì)胞凋亡。所以平時(shí)要在暗處保存細(xì)胞核培養(yǎng)基，避免熒光暴露。

6)不精確的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法將導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)不良

a.確保計(jì)數(shù)樣本充分混合，避免局部細(xì)胞密度差異影響精確計(jì)數(shù)

b.再次檢查使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)的所有運(yùn)算

細(xì)胞增殖變慢有以下原因：1. 消化過(guò)度 2. 傳代過(guò)密 3.細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)不良 4.細(xì)胞頻繁傳代 5.細(xì)胞狀態(tài)不佳或老化 6.細(xì)胞存在污染。

21.細(xì)胞解凍后缺少活力，活細(xì)胞占比較低

這種現(xiàn)象可能主要由以下幾種原因所導(dǎo)致

1)培養(yǎng)物凍存液等質(zhì)量欠缺

解決方案

a.確保用來(lái)制備儲(chǔ)存物(凍存液)的起始培養(yǎng)物需要保證其健康、無(wú)微生物污染、處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期后期狀態(tài)。

b.收獲細(xì)胞時(shí)需要小心翼翼，避免細(xì)胞損傷。

2)儲(chǔ)存物凍存方法不當(dāng)

解決方案

a.在液氮冷凍細(xì)胞時(shí)，確保細(xì)胞、培養(yǎng)基和其他試劑的濃度，以及凍存實(shí)驗(yàn)步驟依照供應(yīng)商的建議。一般來(lái)說(shuō)，凍存應(yīng)該緩慢，大約1-3° C/min以減少冰晶形成。

b.使用電子可編程或機(jī)械冷凍裝置以確保一致的、適當(dāng)速率的冷凍。

c.選擇最合適的細(xì)胞冷凍保護(hù)劑。如果使用甘油，不要將其存儲(chǔ)在光照下，因?yàn)槠毓鈺?huì)使甘油轉(zhuǎn)化為有對(duì)細(xì)胞毒性的丙烯醛。

3)儲(chǔ)存物保存不當(dāng)

解決方案

a.儲(chǔ)存物應(yīng)時(shí)刻保持在-130℃，理想情況是置于液氮中，以確保較大的細(xì)胞活性。

b.如果將細(xì)胞直接浸入液氮中，容易造成液氮泄露到凍存管內(nèi)，解凍時(shí)會(huì)有凍存管爆炸的風(fēng)險(xiǎn)。所以一般儲(chǔ)存在液氮上方的氣相環(huán)境中。

4)細(xì)胞解凍方法不當(dāng)

解決方案

a.一般來(lái)說(shuō)，細(xì)胞應(yīng)該快速解凍、使用預(yù)熱的培養(yǎng)基、盡快移除含有冷凍保護(hù)劑的培養(yǎng)基防止細(xì)胞活力下降。

b.確保小心操作細(xì)胞。不要渦旋或高速離心，因?yàn)榈蜏乇４婧蟮奶貏e容易受到損傷。

22.細(xì)胞進(jìn)行解凍或傳代后細(xì)胞的附著力偏低

這種情況主要是因?yàn)闈穸冗^(guò)低致使培養(yǎng)容器上集聚靜電所致

可以通過(guò)適當(dāng)增加房間濕度，使用防靜電裝置或者用消毒過(guò)的濕毛巾擦拭培養(yǎng)容器外側(cè)，來(lái)減低靜電產(chǎn)生。另外試劑混合不均勻，培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)速等因素也可導(dǎo)致此現(xiàn)象發(fā)生。所以在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，要確保細(xì)胞和所有試劑的溶液混合充分。在使用振蕩培養(yǎng)箱進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，注意設(shè)置適宜的轉(zhuǎn)速。

23.培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用5%或10%CO2

一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的CO2濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3含量為每公升3.7 g時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用10% CO2;當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3為每公升1.5 g時(shí)，則應(yīng)使用5% CO2培養(yǎng)細(xì)胞。

24.CO2培養(yǎng)箱之水盤(pán)如何保持清潔

定期(每周一次)更換水盤(pán)里面的水，水盤(pán)的水必須使用無(wú)菌蒸餾水或無(wú)菌去離子，水盤(pán)中可添加1%硫酸銅以預(yù)防霉菌污染。

25.細(xì)胞接種密度多少合適

依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的接種密度或稀釋分盤(pán)的比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)的一個(gè)重要原因。按照我們的經(jīng)驗(yàn)：一般倍增時(shí)間24 h內(nèi)的細(xì)胞，傳代比率1:6-1:12為宜，倍增時(shí)間24-48 h的細(xì)胞，傳代比率1:3-1:8為宜，倍增時(shí)間超過(guò)48h的細(xì)胞, 傳代比率1:2-1:4為宜。

26.培養(yǎng)用dish,flask是否相同

不同廠牌的dish或flask，其所coating的polymer不同，制造程序亦不同，雖對(duì)大部分細(xì)胞沒(méi)有太大之影響，惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之dish或flask而有顯著之生長(zhǎng)差異。