NK細(xì)胞高效擴(kuò)增試劑盒說明書

產(chǎn)品介紹

采用自體外周血細(xì)胞中分離得到的單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)體外操作使 NK 細(xì)胞擴(kuò)增活化，通過激活體內(nèi)免疫反應(yīng)達(dá)到殺滅腫瘤細(xì)胞。本產(chǎn)品能夠?qū)⑼庵苎械膯蝹€(gè)核細(xì)胞大規(guī)模擴(kuò)增成NK細(xì)胞，具有操作簡單，無需預(yù)包被，擴(kuò)增效率高，目的細(xì)胞百分比高的特點(diǎn)，起始單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)過14天培養(yǎng)，CD3-/CD56+NK細(xì)胞絕對數(shù)量可擴(kuò)增達(dá)到1000倍，其純度可達(dá)80%以上。

產(chǎn)品信息

適用范圍

用于外周血或臍血體外誘導(dǎo)擴(kuò)增NK細(xì)胞。

有效期：十二個(gè)月

樣本要求

單個(gè)核細(xì)胞存活率高于90%，新鮮外周血來源的單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)建議控制在(20-25)×106個(gè)；臍血來源和凍存的外周血來源的單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)建議控制在(25-30)×106個(gè)。

NK細(xì)胞分離培養(yǎng)操作步驟

1、所需主要試劑耗材

2、操作方法

2.1血液分離

血液樣本量25 mL 時(shí)， 實(shí)驗(yàn)方法如下(需根據(jù)PBMC分離液的實(shí)際說明書進(jìn)行調(diào)整)：

(1)取5支 15 mL 離心管， 各加入 5 mL PBMC分離液(與血液體積相同)。

(2)吸取血液樣本加于分離液之液面上， 800 g，離心 20 min，慢升慢降，若血液儲存超過2小時(shí)，請將離心時(shí)間增加至30 min。

(3)離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。第一層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。

分離圖例

2.2滅活自體血漿

(1)收集上層血漿到新的離心管中;

(2)56 ℃加熱血漿 30 min(可加8%葡萄糖酸鈣注射液混勻后共同滅活);

(3)室溫下，1200 xg 離心 10 min;

(4)用移液管將上清液收集至新的離心管，4 ℃保存，直至使用前取出。

2.3制備PBMC

(1)吸取第二層環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層到另一 15 mL離心管中，向所得離心管中加入 10 mL 清洗液，混勻細(xì)胞。

(2)500 xg，離心 10 min，棄上清。

(3)重復(fù)洗滌3次，棄上清。

2.4 NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)

(1)完全培養(yǎng)基的配制：分別添加500 μL NK 添加劑A、NK 添加劑B、NK 添加劑C、NK 添加劑D因子加入到2瓶1L基礎(chǔ)培養(yǎng)基中(按照1:2000比例添加)。

(2)Day 0：用25 mL完全培養(yǎng)基重懸PBMC，加5%自體血漿，鋪于T75瓶中。

(3)Day 3: 補(bǔ)加25 mL培養(yǎng)基(含NK 添加劑A、NK 添加劑B、NK 添加劑C、NK 添加劑D因子)，加5%自體血漿，此時(shí)瓶子含50 mL培養(yǎng)基。一般情況下，培養(yǎng)液顏色發(fā)生變化或細(xì)胞較多時(shí)添加。

(4)Day 5: 往培養(yǎng)瓶中補(bǔ)加50 mL培養(yǎng)基(含NK 添加劑A、NK 添加劑B、NK 添加劑C、NK 添加劑D因子)，加5%自體血漿，轉(zhuǎn)入T225瓶中，此時(shí)瓶子含100 mL培養(yǎng)液。

(5)Day 7: 往瓶中補(bǔ)加150 mL培養(yǎng)基(含NK 添加劑A、NK 添加劑B、NK 添加劑C、NK 添加劑D因子)，另外往培養(yǎng)基中補(bǔ)加NK 添加劑E(按照NK 添加劑E因子與培養(yǎng)基的比例為1:2000添加)，細(xì)胞濃度控制在1.0×106 Cell/mL，加1%自體血漿，此時(shí)瓶中含250 mL 培養(yǎng)液，細(xì)胞轉(zhuǎn)袋前將培養(yǎng)瓶底部的細(xì)胞進(jìn)行輕微吹散細(xì)胞，切勿劇烈吹打。

(6)Day 9: 往培養(yǎng)袋補(bǔ)加250 mL培養(yǎng)基(含NK 添加劑A、NK 添加劑B、NK 添加劑C、NK 添加劑D、NK 添加劑E因子)，加1%自體血漿，此時(shí)袋子含500 mL培養(yǎng)液。

(7)Day 11: 往培養(yǎng)袋補(bǔ)加500 mL培養(yǎng)基(含NK 添加劑A、NK 添加劑B、NK 添加劑C、NK 添加劑D、NK 添加劑E因子)，加1%自體血漿，此時(shí)袋子含1000 mL培養(yǎng)液。

(8)Day 13：往培養(yǎng)袋補(bǔ)加1000 mL培養(yǎng)基(含NK 添加劑A、NK 添加劑B、NK 添加劑C、NK 添加劑D、NK 添加劑E因子)，此時(shí)袋子含2000 mL培養(yǎng)液。

(9)推薦細(xì)胞濃度8-9天應(yīng)控制在(1.0-1.5)×106 Cell/mL，第10-11天應(yīng)控制在(1.5-2.0)×106 Cell/mL。

由于樣品個(gè)體差異、培養(yǎng)方式調(diào)整等因素，培養(yǎng)液體積會出現(xiàn)上下浮動，需要對NK細(xì)胞生長狀況進(jìn)行觀察分析后，進(jìn)行調(diào)整。

2.5 細(xì)胞收集

(1)培養(yǎng) 14 天，擴(kuò)大培養(yǎng)成功后取樣檢測細(xì)胞表型、真菌、細(xì)菌、支原體、內(nèi)毒素等指標(biāo);

(2)收集培養(yǎng) 14 天后的細(xì)胞，將細(xì)胞懸浮液從培養(yǎng)袋轉(zhuǎn)入離心瓶，以 680 g 離心 10 分鐘;

(3)棄去細(xì)胞上清液，用含有 0.1%人血白蛋白的生理鹽水懸浮細(xì)胞，收集到一個(gè)離心瓶中。重復(fù)離心，清洗細(xì)胞 3 次;

(4)通過一次性細(xì)胞篩過濾，收集并注入含有 1%人血白蛋白的生理鹽水中。

性能展示

新鮮外周血樣本25ml，初始陽性率3%，培養(yǎng)14天后NK細(xì)胞絕對數(shù)量擴(kuò)增達(dá)到1000倍，CD3-/CD56+比例達(dá)81.4%。

注意事項(xiàng)

1.血液采集建議使用肝素鈉抗凝管或枸櫞酸鈉采血袋。

2.自體血漿會影響細(xì)胞的培養(yǎng)狀態(tài)，建議自體血漿預(yù)留量為30 mL左右。溶血、高脂肪可能會影響NK細(xì)胞的擴(kuò)增。

3.前7天補(bǔ)液時(shí)，必須將培養(yǎng)基進(jìn)行室溫平衡或者水浴箱溫育培養(yǎng)基，避免低溫對細(xì)胞生長的影響。

4.細(xì)胞培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)前7天出現(xiàn)細(xì)胞成團(tuán)屬于正?，F(xiàn)象，操作過程請注意不要破壞細(xì)胞團(tuán)。

5.如果試劑外包裝管出現(xiàn)裂縫，應(yīng)立即停止使用。

6.應(yīng)嚴(yán)格按照貯存要求貯存。

7. 操作過程應(yīng)在無菌環(huán)境下進(jìn)行,必須保證操作過程中使用的所有容器及所有直接接觸細(xì)胞液的器具嚴(yán)格無菌。

8.本試劑開封后必須一次性使用完畢，不得反復(fù)凍融。

9.非最后的確定版本，隨著研究的進(jìn)步，日后會繼續(xù)更新。

10.實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的洗滌液和各種廢棄物應(yīng)根據(jù)相應(yīng)法規(guī)和地方監(jiān)管部門要求進(jìn)行處理。