產(chǎn)品介紹

γδT細(xì)胞具有在體內(nèi)快速反應(yīng)的特性，在受到刺激時(shí)，會(huì)先于αβ-T細(xì)胞釋放促炎性細(xì)胞因子(IFN-γ和TNF-α等)。γδT細(xì)胞能夠激活NK細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞毒作用，與DC細(xì)胞互刺激成熟， APC細(xì)胞抗原呈遞的功能，激活αβ-T細(xì)胞的免疫效應(yīng)， γδT細(xì)胞的殺傷作用具有非MHC限制性，廣泛的殺瘤譜，已知對至少十幾種腫瘤細(xì)胞有殺傷作用。γδT細(xì)胞在人外周血含量很少(1-5%)，本產(chǎn)品能夠?qū)⑼庵苎械膯蝹€(gè)核細(xì)胞大規(guī)模擴(kuò)增成γδT細(xì)胞，具有擴(kuò)增效率高，目的細(xì)胞百分比高的特點(diǎn)，起始單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)過14天培養(yǎng)，γδT細(xì)胞絕對數(shù)量最高可擴(kuò)增達(dá)到1000倍，其純度最高可達(dá)90%以上。

γT細(xì)胞高效擴(kuò)增試劑盒說明書

產(chǎn)品信息

適用范圍

用于外周血或臍血體外誘導(dǎo)擴(kuò)增γδT細(xì)胞。

有效期：十二個(gè)月

γδT細(xì)胞分離擴(kuò)增步驟

樣本要求

單個(gè)核細(xì)胞存活率高于90%，新鮮外周血來源的單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)建議控制在(20-25)×10*6個(gè)；臍血來源和凍存

的外周血來源的單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)建議控制在(25-30)×10*6個(gè)。

γδT細(xì)胞操作步驟

1、所需主要試劑耗材

2、操作方法

2.1血液分離

血液樣本量25 mL 時(shí)， 實(shí)驗(yàn)方法如下：

(1)取5支 15 mL 離心管， 各加入 5 mL PBMC分離液(與血液體積相同)。

(2)吸取血液樣本加于分離液之液面上， 800 g，離心 20 min，慢升慢降，若血液儲(chǔ)存超過2小時(shí)，請將離心時(shí)間增加至30 min。

(3)離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。第一層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。

分離圖例

2.2滅活自體血漿

(1)收集上層血漿到新的離心管中;

(2)56 ℃加熱血漿 30 min(可加8%葡萄糖酸鈣注射液混勻后共同滅活);

(3)室溫下，1200 g 離心 10 min;

(4)用移液管將上清液收集至新的離心管，4 ℃保存，直至使用前取出。

2.3制備PBMC

(1)吸取第二層環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層到另一 15 mL離心管中，向所得離心管中加入 10 mL 清洗液，混勻細(xì)胞。

(2)500 xg，離心 10 min，棄上清。

(3)重復(fù)洗滌3次，棄上清。

2.4 γδT細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)

(1)完全培養(yǎng)基的配制：500 μL γδT 添加劑B加入1 L基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。

(2)D0：用30 mL完全培養(yǎng)基重懸PBMC，加入150 μL γδT 添加劑A ，加5%自體血漿，鋪于T75瓶中。

(3)D3: 補(bǔ)加30 mL培養(yǎng)基(含γδT 添加劑B)，加5%自體血漿，此時(shí)瓶子含60 mL培養(yǎng)基。一般情況下，培養(yǎng)液顏色發(fā)生變化或細(xì)胞較多時(shí)添加。

(4)D5: 往培養(yǎng)袋補(bǔ)加60 mL培養(yǎng)基(含γδT 添加劑B)，加5%自體血漿，轉(zhuǎn)入T225培養(yǎng)瓶，此時(shí)瓶子含120 mL培養(yǎng)液。

(5)D7: 往培養(yǎng)袋補(bǔ)加130 mL培養(yǎng)基(含 γδT 添加劑B)，細(xì)胞濃度控制在(0.8-1.0)×106 Cell/mL，加1%自體血漿，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)袋，此時(shí)袋子含250 mL 培養(yǎng)液，細(xì)胞轉(zhuǎn)袋前將培養(yǎng)瓶底部的細(xì)胞進(jìn)行輕微吹散細(xì)胞，切勿劇烈吹打。

(6)D9: 往培養(yǎng)袋補(bǔ)加250 mL培養(yǎng)基(含γδT 添加劑B)，自體血漿按1%添加，此時(shí)袋子含500 mL培養(yǎng)液。

(7)D11: 往培養(yǎng)袋補(bǔ)加500 mL培養(yǎng)基(含γδT 添加劑B)，此時(shí)袋子含1000 mL培養(yǎng)液。

(8)D13：往培養(yǎng)袋補(bǔ)加1000 mL培養(yǎng)基(含γδT 添加劑B)。推薦細(xì)胞濃度8-9天應(yīng)控制在(1.0-1.5)×106 Cell/mL，第10-11天應(yīng)控制在(1.5-2.0)×106 Cell/mL。

由于樣品個(gè)體差異、培養(yǎng)方式調(diào)整等因素，培養(yǎng)液體積會(huì)出現(xiàn)上下浮動(dòng)，需要對γδT細(xì)胞生長狀況進(jìn)行觀察分析后，進(jìn)行調(diào)整。

2.5 細(xì)胞收集

(1)培養(yǎng) 14 天，擴(kuò)大培養(yǎng)成功后取樣檢測細(xì)胞表型、真菌、細(xì)菌、支原體、內(nèi)毒素等指標(biāo);

(2)收集培養(yǎng) 14 天后的細(xì)胞，將細(xì)胞懸浮液從培養(yǎng)袋轉(zhuǎn)入離心瓶，以 680 g 離心 10 分鐘;

(3)棄去細(xì)胞上清液，用含有 0.1%人血白蛋白的生理鹽水懸浮細(xì)胞，收集到一個(gè)離心瓶中。重復(fù)離心，清洗細(xì)胞 3 次;

(4)通過一次性細(xì)胞篩過濾，收集并注入含有 1%人血白蛋白的生理鹽水中。

注意事項(xiàng)

1、血液采集建議使用肝素鈉抗凝管或枸櫞酸鈉采血袋。

2、自體血漿會(huì)影響細(xì)胞的培養(yǎng)狀態(tài)，建議自體血漿預(yù)留量為30 mL左右。溶血、高脂肪可能會(huì)影響γδT細(xì)胞的擴(kuò)增。

3、前7天補(bǔ)液時(shí)，必須將培養(yǎng)基進(jìn)行室溫平衡或者水浴箱溫育培養(yǎng)基，避免低溫對細(xì)胞生長的影響。

4、如果試劑外包裝管出現(xiàn)裂縫，應(yīng)立即停止使用。

5、應(yīng)嚴(yán)格按照貯存要求貯存。

6、操作過程應(yīng)在無菌環(huán)境下進(jìn)行，必須保證操作過程中使用的所有容器及所有直接接觸細(xì)胞液的器具嚴(yán)格無菌。

7、本試劑開封后必須一次性使用完畢，不得反復(fù)凍融。

9、細(xì)胞培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)前7天出現(xiàn)細(xì)胞成團(tuán)屬于正?，F(xiàn)象，操作過程請注意不要破壞細(xì)胞團(tuán)。

10、實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的洗滌液和各種廢棄物應(yīng)根據(jù)相應(yīng)法規(guī)和地方監(jiān)管部門要求進(jìn)行處理。